西藏靈菇發(fā)酵奶對小鼠免疫功能的影響初探

薄芯，李京霞

（北京聯(lián)合大學(xué)師范學(xué)院，北京 100011）

西藏靈菇發(fā)酵奶對小鼠免疫功能的影響初探

薄芯，李京霞

（北京聯(lián)合大學(xué)師范學(xué)院，北京 100011）

以西藏靈菇發(fā)酵奶為研究對象，以小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、溶血空斑實驗和遲發(fā)性致敏反應(yīng)實驗為檢測對象，初步研究其免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明：西藏靈菇發(fā)酵奶實驗組的巨噬細(xì)胞吞噬率有所增加，低劑量組吞噬率增加83.78%，中劑量組增加87.39%，高劑量組增加102.7%。實驗組小鼠的溶血空斑數(shù)也明顯增加，低劑量組增加22.52%，中劑量組增加49.18%，高劑量組增加55.53%。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中實驗組的足跖增厚明顯，低劑量組的足跖厚度增加了19%，中劑量組增加了29%，高劑量組增加了47%。均呈現(xiàn)有量效關(guān)系。說明西藏靈菇發(fā)酵奶具有增強(qiáng)動物免疫功能的作用。

西藏靈菇發(fā)酵奶；巨噬細(xì)胞吞噬率；溶血空斑；遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；免疫增強(qiáng)

0 引言

西藏靈菇發(fā)酵奶（Tibetan kefir fermentation milk）是用西藏靈菇菌粒（Tibetan kefir grain）在牛乳中發(fā)酵制成的傳統(tǒng)發(fā)酵乳飲品[1，2]。傳說有治療高血壓、冠心病、胃腸道疾病、提高免疫力，解除疲勞等功效[3]，但相關(guān)機(jī)理的科研報道很少。國內(nèi)對西藏靈菇的研究主要局限于菌群、菌相和組成[4-6]。國外研究多限于對西藏靈菇菌粒的研究[7]。臨床證明西藏靈菇發(fā)酵奶有調(diào)節(jié)慢性腸道疾病[8]，降血脂[9]、降血壓[10]和抑制腫瘤[11]、抗疲勞，延緩衰老等作用[12]。我們曾對西藏靈菇發(fā)酵奶進(jìn)行急毒、亞急毒、微核檢測、精子畸形試驗等研究[13]，并證明其對消化系統(tǒng)有保健作用[14]?，F(xiàn)通過對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率（abdominal cavity macrophage phagocytosis rate）、脾淋巴細(xì)胞溶血空斑（plaque forming cell，PFC）和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（delayed-type hypersensitivity，DTH）實驗驗證其是否具有免疫增強(qiáng)作用的功能。

1 實驗

1.1 材料及儀器

WFJ UV-2000型分光光度計，LX3-64-01型高速離心機(jī)，LRH-250A生化培養(yǎng)箱，pH-S-25型pH計，YXQ-SG46-280S不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器，AUY220型電子天平，Leica BME生物顯微鏡。

西藏靈菇菌粒，光明純鮮牛奶；1%綿羊紅細(xì)胞（SRBC）懸液、6%可溶性淀粉肉湯、補(bǔ)體（豚鼠新鮮血清）、瑞氏染液、Hanks液（含5%小牛血清）。

實驗動物為雄性ICR小鼠，體質(zhì)量為（20±2）g（飼養(yǎng)批準(zhǔn)號：SYXK（京）2006-0025）。

1.2 方法

1.2.1 西藏靈菇發(fā)酵奶的制備

將洗凈的西藏靈菇接入鮮牛奶中，接種量為5%，在生化培養(yǎng)箱中于（27±1）℃進(jìn)行發(fā)酵，至第24 h發(fā)酵結(jié)束。此時西藏靈菇發(fā)酵奶的pH值為3.7～3.8之間，形態(tài)為半凝固態(tài)。過濾除去西藏靈菇，冰箱冷藏保存，3 d內(nèi)使用。

1.2.2 巨噬細(xì)胞吞噬功能實驗

巨噬細(xì)胞（macrophage）具有吞噬大顆粒特異物的特性，用綿羊紅細(xì)胞（Sheep Red Blood Cell，SRBC）作為吞噬顆粒注入小鼠腹腔，腹腔中巨噬細(xì)胞則將SRBC吞入。取小鼠腹腔液涂片，染色后可見SRBC被吞噬的現(xiàn)象，計數(shù)100個巨噬細(xì)胞中吞噬SRBC的細(xì)胞數(shù)可判斷其吞噬功能。將50只小鼠于實驗室適應(yīng)喂養(yǎng)24 h,隨機(jī)分成2個對照組（空白對照組、陰性對照組）和高、中、低劑量3個實驗組，每組10只小鼠。各組每只小鼠每日分2次灌胃，共灌胃30 d，具體灌胃劑量如表1所示。第27天小鼠腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%可溶性淀粉肉湯1 mL，第30天小鼠腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SRBC懸液2 mL，并輕揉腹部。30 min后，將小鼠處死，取腹腔液涂片并進(jìn)行瑞氏染色，顯微鏡觀察涂片，計數(shù)巨噬細(xì)胞，計算吞噬陽性細(xì)胞的百分率。

表1 小鼠分組及給藥劑量

1.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞溶血空斑實驗

溶血空斑實驗是用于體外檢查和計數(shù)抗體形成細(xì)胞的方法。先用SRBC免疫動物，隨后取被免疫動物的脾制成淋巴細(xì)胞懸液，再與高濃度的SRBC混合，則能釋放溶血性抗體的細(xì)胞可致敏其周圍的SRBC。當(dāng)加入補(bǔ)體時，致敏的SRBC被溶解形成了局部的溶血空斑。通過計數(shù)溶血空斑數(shù)量對動物產(chǎn)生抗體的能力進(jìn)行評估。SRBC制備：取脫纖維SRBC，生理鹽水洗3次，前兩次1 500 r/min，10 min，最后1次2 500 r/min，15 min，取壓積SRBC配制15%SRBC懸液。小鼠數(shù)量、分組及喂食劑量如表1所示。灌胃第26天用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的SRBC 0.4 mL（約4×108個細(xì)胞）注射于小鼠腹腔，第30天脫頸處死，取脾臟放入平皿，加5 mL的Hanks液，用注射器芯研磨后過100目不銹鋼網(wǎng)，濾液經(jīng)1 000 r/min離心5 min，共洗2次。將沉淀脾細(xì)胞重懸于Hanks液中，計數(shù)配成1×107mL-1濃度的脾細(xì)胞懸液。取新鮮豚鼠血清與Hanks液以1︰2的濃度配制成補(bǔ)體溶液。取脾細(xì)胞懸液50 μL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SRBC 50 μL，補(bǔ)體溶液50 μL，Hanks液250 μL混勻，注入100 μL的小室中，石蠟封口，37℃溫育1.5 h，取出觀察并進(jìn)行空斑計數(shù)，計算出每組脾細(xì)胞中含空斑形成細(xì)胞的平均值。

1.2.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是一項全面的檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的第Ⅱ類實驗，可表達(dá)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的炎癥反應(yīng)。小鼠數(shù)量、分組及灌胃劑量如表2所示，共灌胃30 d。第24天用0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的SRBC（約1×106個細(xì)胞）注射小鼠腹腔進(jìn)行致敏；第28天測量小鼠右后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SRBC（約1×102個細(xì)胞）；注射后于24 h和48 h分別測量右后足跖部厚度，同一部位各測量3次，取平均值。

表2 小鼠分組及給藥劑量

2 結(jié)果

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能實驗結(jié)果如表3所示；表4為小鼠脾淋巴細(xì)胞溶血空斑實驗結(jié)果；表5為小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗結(jié)果。

表3 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能實驗結(jié)果

表4 脾淋巴細(xì)胞溶血空斑實驗結(jié)果

表5 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗結(jié)果（足跖部厚度）mm

3 討論

從實驗數(shù)據(jù)可以得知，西藏靈菇發(fā)酵奶具有較好的提高小鼠免疫功能和抗疲勞作用。

3.1 對小鼠吞噬細(xì)胞作用功能的影響

由表3可以看出，3組實驗組的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率比2組對照組的吞噬率都有明顯的提高，低劑量組吞噬率增加83.78%，中劑量組增加87.39%，高劑量組增加102.7%，經(jīng)過t檢驗都具有極極顯著的差異，說明西藏靈菇發(fā)酵奶確實有較好的提高小鼠細(xì)胞免疫的功能。而陰性對照組與空白對照組之間的差異沒有顯著性，說明僅服用一般的牛奶不能達(dá)到提高小鼠細(xì)胞免疫的作用。實驗組之間的比較可以看出：中劑量組與低劑量組之間沒有顯著性差異，但高劑量組與低劑量組和中劑量組之間均有顯著性差異。說明3組實驗組具有一定的量效關(guān)系，隨所給劑量的增加，吞噬率也隨之增加。吞噬率的上升說明西藏靈菇發(fā)酵奶具有提高巨噬細(xì)胞清除外來物質(zhì)，提高抗原提呈的功能，能夠提高動物免疫功能。

3.2 對小鼠體液免疫功能的影響

實驗結(jié)果表明：西藏靈菇發(fā)酵奶可以提高小鼠脾淋巴細(xì)胞形成溶血空斑的數(shù)量。由于溶血空斑數(shù)量的上升與其形成的抗體量成正比，則證明西藏靈菇發(fā)酵奶能夠提高小鼠體內(nèi)的抗體數(shù)量，數(shù)量故提高了小鼠的體液免疫功能。由表4可以看出，實驗組的空斑數(shù)與對照組的空斑數(shù)相對照有明顯的增加，而且隨著給藥劑量的增加，空斑數(shù)目也隨之增加。其中，低劑量組增加22.52%，中劑量組增加49.18%，高劑量組增加55.53%；低劑量組與空白對照組相比有極顯著差異，與陰性對照組相比有顯著性差異。中、高劑量組與空白對照組相比有極極顯著差異。中、高劑量組與陰性對照組相比分別有極顯著和極極顯著差異。低劑量組與中、高劑量組之間均有顯著性差異，但中劑量組與高劑量組之間沒有顯著性差異。說明在一定范圍內(nèi)增加西藏靈菇發(fā)酵奶的用量可以呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，但當(dāng)使用劑量達(dá)到一定量后，提高免疫力的效果將不再升高。

3.3 對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

實驗結(jié)果表明：西藏靈菇發(fā)酵奶可以提高小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。在此反應(yīng)中，免疫系統(tǒng)通過識別及處理抗原，促進(jìn)T細(xì)胞母細(xì)胞化及增殖，使記憶T細(xì)胞向抗原暴露的激發(fā)部位遷移，繼而產(chǎn)生炎癥調(diào)節(jié)因子和淋巴因子引起炎癥反應(yīng)。經(jīng)激發(fā)后，24 h開始出現(xiàn)肉眼可見及可觸到的腫脹，48 h腫脹達(dá)到最高值。測量腫脹的程度并與未進(jìn)行激發(fā)前進(jìn)行比較，可評價機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。從表5數(shù)據(jù)可看出：陽性對照組和3個實驗組小鼠足跖部腫脹程度與空白對照組之間有差異，其中，中、高劑量組的差異顯著。高劑量組與陽性對照組之間差異顯著。說明酸奶和西藏靈菇發(fā)酵奶均可提高小鼠的細(xì)胞免疫功能，但西藏靈菇發(fā)酵奶的作用更為明顯，并具有一定的量效關(guān)系。其在細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)過程中的具體機(jī)理，尚需要進(jìn)一步的實驗研究。

4 結(jié)論

通過小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬力、小鼠脾淋巴細(xì)胞溶血空斑量和小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)等實驗證明：西藏靈菇發(fā)酵奶可以提高動物的清除外來異物、抗原提呈功能、特異性免疫中的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，而且提高免疫功能與灌胃劑量之間具有一定的量效關(guān)系。證明西藏靈菇酸發(fā)酵奶確有較好的保健功能，對于其產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

[1]劉慧.開菲爾粒中乳酸菌的分離方法研究[J].食品科學(xué),2004,6（20）:56-60.

[2]劉慧.功能性開菲爾酸奶最佳發(fā)酵條件的研究[J].食品工業(yè),2003, (1):26-27.

[3]劉慧.開菲爾的生理功能、特性及其產(chǎn)品開發(fā)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2005,26(4):252-255.

[4]孫培靈.西藏靈菇優(yōu)勢菌的分離純化及其發(fā)酵特性的研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2002.

[5]金世琳.古老而新型的酒精性發(fā)酵乳飲料—開菲爾[J].中國乳品工業(yè),1999,27(2):18-23.

[6]張慧敏.開菲爾的營養(yǎng)成分、保健功能及其產(chǎn)品研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技,2005,21(4):118-119,132.

[7]劉慧.開菲爾粒中酵母菌的分離及其發(fā)酵性能的研究[J].食品科學(xué), 2005,26(2):97-100.

[8]李永奇.藏靈菇奶對慢性腸道疾病功能調(diào)節(jié)作用的臨床觀察[J].河南中醫(yī),2005,25(3):41-42.

[9]肖琳琳.干酪乳桿菌KM-16的篩選及其降膽固醇活性研究[J].中國乳品工業(yè),2003,31(6):7-10.

[10]張利娜.靈菇菌乳Ⅰ號Ⅱ號對高血壓模型大鼠的降壓作用的實驗研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[11]劉宇峰.西藏靈菇乳對腫瘤的抑制作用[J].畜牧獸醫(yī)科技信息, 2005(6):56-57.

[12]張列兵,程濤.Kefir的營養(yǎng)特性及保健作用[J].中國乳品工業(yè), 1997,25(3):36-37.

[13]薄芯,李京霞.西藏靈菇奶一般毒性和生殖毒性的初步探索[J].中國乳品工業(yè),2007,35(8):28-30.

[14]薄芯,李京霞.西藏靈菇發(fā)酵奶對小鼠消化系統(tǒng)的保健作用探索[J].中國乳品工業(yè),2010,38(7):29-31.

Study on immunity effected by the Tibetan kefir fermentation milk

BO Xin，LI Jing-xia
(Normal College of Beijing Union University,Beijing 100011,China)

The experiment used the Tibetan kefir fermentation milk as object,the abdominal cavity macrophage phagocytosing rate,plaque forming cell(PFC)and delayed-type hypersensitivity(DTH)of mice as models,study the actions of the Tibetan kefir fermentation milk to immune system.The results show that:macrophage phagocytosis rate of experimental groups were higher 83.78%～102%than the matched groups,the number of PFC creased 22.52%～55.53%,and the DTH raised 19%～47%.And there were dose-effect relation in the Tibetan kefir fermentation milk.The results proved that the Tibetan kefir fermentation milk show immunoenhancement to immune system,and take health care to animals.

Tibetan kefir fermentation milk；macrophage phagocytosis rate；plaque forming cell(PFC)；delayed-type hypersensitivity(DTH)；immunoenhancement

TS252.54

A

1001-2230（2011）06-0019-03

2011-03-22

薄芯（1958-），女，副教授，從事藥理及毒理學(xué)方面的研究。