酶聯(lián)免疫法與乳及乳制品中抗生素殘留的檢測(cè)

邵輝，吳瑕，王劍飛，王鑫，

（1.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心哈爾濱 150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，哈爾濱 150030）

酶聯(lián)免疫法與乳及乳制品中抗生素殘留的檢測(cè)

邵輝1，吳瑕2，王劍飛3，王鑫2，

（1.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心哈爾濱 150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，哈爾濱 150030）

對(duì)酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)（ELISA）做了介紹，并對(duì)該技術(shù)在乳及乳制品抗生素殘留檢測(cè)的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)述。闡述了該項(xiàng)技術(shù)在乳及乳制品抗生素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用前景。

酶聯(lián)免疫；乳及乳制品；抗生素殘留；快速檢測(cè)

0 引言

牛奶是人們的主要營(yíng)養(yǎng)品，牛奶中若含有抗生素，對(duì)長(zhǎng)期飲者來(lái)說(shuō)無(wú)疑等于長(zhǎng)期服用小計(jì)量的抗生素，對(duì)抗生素有過(guò)敏體制的人群引用，可引起過(guò)敏反應(yīng)[1]，輕至各種皮疹，重至過(guò)敏性休克甚至危害生命[2]。從乳制品加工角度來(lái)看，原料乳中抗生素殘留會(huì)嚴(yán)重干擾發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，嚴(yán)重影響干酪、黃油、發(fā)酵乳的發(fā)酵和后期風(fēng)味的形成[3]。因此，大多數(shù)國(guó)家開始對(duì)乳及乳制品抗生素殘留問(wèn)題提出更高的要求，檢測(cè)技術(shù)日益趨于高技術(shù)、速測(cè)化、便攜化和易商品化發(fā)展。運(yùn)用免疫學(xué)和生物工程技術(shù)所建立的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)技術(shù)，在食品安全性檢測(cè)上表現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在測(cè)定乳及乳制品抗生素殘留上有著廣泛的應(yīng)用前景。

1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)

酶聯(lián)免疫技術(shù)是20世紀(jì)60年代在免疫熒光和組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)。1966年，以Engvall、 Perlmann和Schurs為先驅(qū)，發(fā)展了酶聯(lián)免疫測(cè)定方法，到1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)用于IgG定量測(cè)定的文章，使得1996年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法［4］。首次將抗體上的酶標(biāo)記用于兔免疫球蛋白上代替在免疫分析方法中應(yīng)用的常規(guī)放射標(biāo)記。ELISA靈敏度與放射免疫分析法相同。但是和放射免疫分析法不同的是其克服了放射免疫分析方法的缺點(diǎn)如暴露的放射性對(duì)人體健康的潛在危害及不需要用到昂貴的閃爍計(jì)數(shù)器［5，6］。

ELISA的基礎(chǔ)是抗原和抗體的固相化及抗原和抗體的酶標(biāo)記。基本原理是：使抗原抗體結(jié)合到某固相載體的表面，并保持其免疫活性；抗原或抗體與酶結(jié)合形成酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，既保持其免疫活性又保留酶的催化活性；在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗原或抗體）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)；用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)準(zhǔn)受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的靈敏度［4］。在應(yīng)用中一般采用商品化的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其特點(diǎn)是將抗原或抗體制成固相制劑，在與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)后，只需經(jīng)過(guò)固相的洗滌，就可以達(dá)到抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離，簡(jiǎn)化了操作步驟。完整的ELISA試劑盒包含以下組分：包被抗原或抗體的固相載體（固相吸附劑）；酶標(biāo)記的抗原或抗體；酶的底物陰性和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定）；結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；洗滌液；酶反應(yīng)終止液。結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗原或抗體，是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物既保持酶的催化活性，也保持了抗體(或抗原)的免疫活性。在ELISA中常用的酶是臘根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phoaohatase,AP）［7，8］。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國(guó)產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。國(guó)外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶［8］。酶標(biāo)記抗體的制備主要有戊二醛膠聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化兩種方法。酶結(jié)合物一般需經(jīng)離子交換層析或分子篩分離純化。最常用的方法是通過(guò)Sepharose 4B或Sephadex G-200等進(jìn)行膠過(guò)濾。

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。其中抗生素殘留中常用的是以下3種類型［4］：雙抗體夾心法；間接法；競(jìng)爭(zhēng)法。

2 在抗生素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)法和理化方法相比，ELISA方法具有高度的準(zhǔn)確性、特異性、食用范圍寬、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為乳及乳制品中抗生素殘留檢測(cè)中廣泛應(yīng)用的方法。大部分抗生素已經(jīng)建立了ELISA測(cè)定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、四環(huán)素、青霉素、鏈霉素等。吳定等［9］以BSA為載體合成兩種不同摩爾比值（1︰13和1︰42）磺胺甲基嘧啶人工抗原，并比較其免疫原性。免疫家兔后獲得抗SMD多克隆抗體，并已建立了乳中磺胺甲基嘧啶殘留的ELISA方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作濃度為88%～118%。抗血清與磺胺甲基嘧啶和磺胺噻唑交叉反應(yīng)率分別為6.0%和0.84%，而與其他磺胺類藥物無(wú)交叉反應(yīng)。吳定等以BSA為載體合成摩爾比為1︰14的新諾明蛋白質(zhì)免疫原，建立了乳中新諾明殘留競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法［10］。吳定等用2.5%戊二醛作膠聯(lián)劑，分別合成牛血清白蛋白-氨芐西林鈉抗原和卵白蛋白-氨芐西林鈉抗原，建立了快速測(cè)定乳中氨芐西林鈉含量的酶聯(lián)免疫吸附法［11］。楊紅用兔抗磺胺二甲嘧啶血清，建立了磺胺二甲嘧啶的ELISA法［12］，方法簡(jiǎn)便快速，重現(xiàn)性好，檢出限度低。周斌等［13］以人工合成的氯霉素-牛血清白蛋白（CAPBSA）為包被抗原，氯霉素(Chloramphenicol,CAP)為競(jìng)爭(zhēng)的半抗原，建立了快速定量測(cè)定CAP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)。

由于對(duì)乳及乳制品中抗生素殘留量需快速檢測(cè)，眾多開發(fā)商研制開發(fā)了ELISA試劑盒的形式。其基本原理［14］是將特定抗生素類群（如β-內(nèi)酰胺類）作為靶子，讓固定在一定部位的特定的特定抗體或光譜受體（如微生物細(xì)胞）捕捉。大多數(shù)檢測(cè)法利用競(jìng)爭(zhēng)性原理，使樣品內(nèi)的抗生素與內(nèi)置抗生素標(biāo)志物競(jìng)爭(zhēng)固定抗體或光譜受體結(jié)合，然后進(jìn)行沖洗和顯色。內(nèi)置抗生素標(biāo)志物與固定抗體或廣譜受體形成的復(fù)合體，通過(guò)酶的作用分解可形成有色物質(zhì)或發(fā)光物質(zhì)。乳制品中的殘留抗生素與固定抗體或光譜受體形成的復(fù)合體，通過(guò)酶的作用分解無(wú)法形成有色物質(zhì)或發(fā)光物質(zhì)。通過(guò)測(cè)定色度或光度并與參比物對(duì)照，就可判斷結(jié)果呈陰性還是陽(yáng)性。因?yàn)閼?yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性原理，最終的反應(yīng)結(jié)果顏色越深或光度越強(qiáng)表示陰性，反之表示陽(yáng)性。

美國(guó)Idexx實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的針對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的LacTek內(nèi)酰胺檢測(cè)法是一種適合在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的檢測(cè)法，7 min就可以得出結(jié)果。檢測(cè)時(shí)將乳樣和競(jìng)爭(zhēng)性酶示蹤物加入涂有固定抗體的試管中，在室溫下振蕩，使牛奶中抗生素與酶示蹤物競(jìng)爭(zhēng)與固體抗體結(jié)合，然后將試管用沖洗液沖洗，隨后加入顯色劑，顯色結(jié)果用分光光度計(jì)檢測(cè)。如果乳樣中有抗生素殘留，則會(huì)搶占酶示蹤物的結(jié)合位點(diǎn)，使酶示蹤物在沖洗時(shí)被洗掉，加入顯色劑后，形成色度較淺或并無(wú)顯色現(xiàn)象。該實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的SNAP檢測(cè)法，由一個(gè)試管和一個(gè)裝有試劑的一次性塑料裝置組成，它利用毛細(xì)管現(xiàn)象拖拽乳樣和酶示蹤物試劑通過(guò)固定抗體。10 min可得到試驗(yàn)結(jié)果。

3 應(yīng)用前景

目前以用于檢測(cè)乳及乳制品抗生素殘留檢測(cè)的方法主要有3種：微生物受阻法、理化檢測(cè)法、免疫學(xué)分析法。微生物受阻法雖然有了新的發(fā)展，但還存在檢測(cè)需時(shí)長(zhǎng)，操作復(fù)雜，很難篩選達(dá)到對(duì)同類抗生素的不同藥敏性的特異菌株等缺點(diǎn)。理化檢測(cè)法設(shè)備昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高，需要復(fù)雜的樣品前處理，很難推廣使用。免疫分析方法中的酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）是目前絕大多數(shù)試劑盒采用的方法，準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，快速便捷，但檢測(cè)費(fèi)用很高，受到對(duì)主要設(shè)備的要求以及供貨連續(xù)性等因素的影響。這些方法雖然各有缺點(diǎn)和局限性，相比之下，在實(shí)際中只有應(yīng)用ELISA檢測(cè)技術(shù)才能最大程度上滿足乳及乳制品抗生素殘留快速檢測(cè)所需求的條件。隨著一些基礎(chǔ)研究的進(jìn)展以及用于食品分析的ELISA試劑盒的大量生產(chǎn)，使ELISA方法的優(yōu)勢(shì)更加明顯，更加符合食品分析要求的準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便易操作，因此可以預(yù)言在未來(lái)的乳及乳制品抗生素殘留檢測(cè)中，ELISA將會(huì)成為很重要的一個(gè)技術(shù)手段，并將引起世界各國(guó)的廣泛重視和深入研究。

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Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and detection of antibiotics residues in milk and milk products

SHAO Hui1,WU Xia2,WANG Jian-fei3,WANG Xin2
（1.Heilongjiang Agriculture Project Profession clooege，Harbin 150001，China;2.Heilongjiang Dairy Industrial and Technical Reseearch Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150086,China；3.Chengdong College of Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China)

In this paper,the technology of Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA)was introduced first.Meanwhile,the application of ELISA in the detection of antibiotics residues in milk and milk products was commented.Finally the prospect of ELISA in the detection of antibiotics residues in milk and milk products was also forward promoted.

ELISA;milk and milk products;antibiotics residues;rapid detection

TS252.7

B

1001-2230（2011）06-0058-02

2010-12-22

邵輝（1977-），女，工程師，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。