過(guò)量表達(dá)大葉補(bǔ)血草LgSOS1基因?qū)M南芥耐鹽性的影響

周玲玲，祝建波，王愛(ài)英

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003）

過(guò)量表達(dá)大葉補(bǔ)血草LgSOS1基因?qū)M南芥耐鹽性的影響

周玲玲，祝建波，王愛(ài)英

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003）

將從鹽生植物大葉補(bǔ)血草（Limonium.gmelinii（Willd.）Kuntze）中分離的質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Lg SOS1構(gòu)建到p CAMBIA1301植物表達(dá)載體的Ca MV35S啟動(dòng)子下游上，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)該植株的PCR和RT－PCR檢測(cè)表明，Lg SOS1已整合到擬南芥基因組中并過(guò)量表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)明顯好于對(duì)照；鹽分測(cè)定表明，轉(zhuǎn)基因植株地上部分的Na＋積累顯著低于野生型的，K＋含量則顯著高于野生型的。這表明Lg SOS1過(guò)量表達(dá)提高了擬南芥植株的耐鹽性。

Lg SOS1基因；質(zhì)膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；擬南芥；耐鹽性

土壤鹽漬化問(wèn)題是困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一大難題，土壤中高濃度的Na＋會(huì)擾亂植物正常的代謝活動(dòng)，影響根細(xì)胞對(duì)K＋的吸收，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停止或死亡［1－2］。Na＋區(qū)隔化和 Na＋外排是植物降低細(xì)胞內(nèi)Na＋濃度的主要方式，這一生理功能由Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成［3］。質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白 則 參 與 Na＋的 外 排［4－5］。Shi等［6－7］研 究 表明，擬南芥質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白At SOS1行使Na＋外排功能，并控制Na＋長(zhǎng)距離運(yùn)輸。過(guò)量表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化體或基因突變體的抗鹽生理結(jié)果表明［8－9］，質(zhì)膜型 Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可調(diào)節(jié)植物的耐鹽能力。文獻(xiàn)［10－11］研究結(jié)果表明，水稻和小麥中的質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也行使類(lèi)似的功能。

有關(guān)鹽生植物的質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的報(bào)道較少［12－13］。我們從泌鹽鹽生植物大葉補(bǔ)血草中克隆了質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Lg SOS1［14］。

本研究將Lg SOS1導(dǎo)入到擬南芥，獲得過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，并分析了鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，這對(duì)進(jìn)一步了解LgSOS1基因的功能及其與擬南芥耐鹽能力之間的關(guān)系具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

選用擬南芥（Ar abidopsis thaliana）Colu mbia生態(tài)型，播種于育苗營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石∶珍珠巖為5∶2∶2的混合介質(zhì)中，每3天澆一次自來(lái)水，溫度為18～22℃。

1.1.2 質(zhì)粒載體及菌種

質(zhì)粒載體：PCAMBIA1301；

農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）：GV3101菌株為石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 酶及化學(xué)試劑

潮霉素溶液為Sigma公司產(chǎn)品，濃度為50 mg／L；卡那霉素和 Taq酶、A MV、RNAase inhibitor、Trizol試劑均購(gòu)自上海生物工程公司；其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.4 儀器設(shè)備

Image Master VDS Pharmacia Biotech凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Biofuge公司），F(xiàn)CP300型三恒電泳儀（北京六一儀器廠），My Cycler T M thermal cycler PCR儀器（Bio RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 植物的生長(zhǎng)

擬南芥種子播種于盛滿(mǎn)混合介質(zhì)（草炭土∶蛭石∶珍珠巖＝5∶2∶2）直徑7 c m的培養(yǎng)杯中，在16 h光照、8 h黑暗的長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)，以促進(jìn)開(kāi)花。當(dāng)植株長(zhǎng)至莖高約3 c m時(shí)，去除其頂生花序，以刺激腋生花序的生長(zhǎng)。待腋生花序長(zhǎng)出，其下部的花已有授粉現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前，將已授粉的花及果莢除掉。

1.2.2 菌液制備及滲透操作

挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于20 mL含有40 mg／L利福平、50 mg／L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃250 r／min震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5左右。在轉(zhuǎn)化前1天，以1∶10比例轉(zhuǎn)接到50 mL含抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，當(dāng)菌液OD600在1.2～1.6之間時(shí)取出，室溫5 000 r／min離心15 min，棄上清，沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基（蔗糖5%，Sil wet L－77 200μL／L）中，OD600在0.8左右。

將農(nóng)桿菌懸浮液倒在小燒杯中，將長(zhǎng)有擬南芥的培養(yǎng)杯倒扣其上，浸泡15 min。取出植株，橫放在塑料盤(pán)中，用保鮮膜封好以保持濕度，放在恒溫室培養(yǎng)。第2天打開(kāi)，豎直培養(yǎng)，仍用保鮮膜保持濕度6－7 d。培養(yǎng)3－4周，待種子成熟后，收取種子。

1.2.3 轉(zhuǎn)化植株的篩選

種子消毒：先用70%的乙醇浸泡2 min，再用1%NaCl O溶液渦漩洗滌15 min，無(wú)菌水漂洗5次，用0.1%的瓊脂重懸浮種子，均勻分散到固體篩選培養(yǎng)基（1×MS，3%蔗糖，0.8%瓊脂，p H 5.7，潮霉素30 mg／L）表面，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。大約2周后即可區(qū)分轉(zhuǎn)化植株與未轉(zhuǎn)化植株，將轉(zhuǎn)化植株移栽到土壤中生長(zhǎng)以收取種子。

1.2.4 轉(zhuǎn)化植株的遺傳分析

為得到純合的轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)化植株要自交三代以上。

取T1代所結(jié)種子，表面消毒后播種于含30 mg／L潮霉素的固體篩選培養(yǎng)基上，萌發(fā)2周后統(tǒng)計(jì)綠苗和黃苗的分離比例（T1代分離比，單位點(diǎn)插入應(yīng)為3∶1），將綠苗移栽到土壤中，培養(yǎng)至成熟，單株收取種子為T(mén)2代種子。

將T2代種子播種于含30 mg／L潮霉素的固體篩選培養(yǎng)基上，其中轉(zhuǎn)基因植株純合子不再發(fā)生分離，這些植株所結(jié)出的T3代種子即為轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)合系，用于耐鹽性實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR和RT－PCR鑒定

提取部分轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥的基因組總DNA，分別用 P1（CCTTAGAGGCGTTTGGTGAT）和 P2（AAAATAAGCAACATGATATGGAAGA）這對(duì)基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以質(zhì)粒CA MBIA1301－LgSOS1作陽(yáng)性對(duì)照。

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株中LgSOS1基因是否表達(dá)，進(jìn)行了RT－PCR檢測(cè)。

其檢測(cè)過(guò)程主要如下：采用Trizol RNA提取試劑提取一個(gè)轉(zhuǎn)基因的純系和野生型擬南芥的RNA，分別取10μL RNA，2.0μL Oligo d T，70℃5～10 min，冰浴5 min，再加入4μL 5×RT buffer，1.0μL d NTP （10 mmol／L），2.0μL Mg Cl2，0.5 μL RNase Inhibitor，0.5μL A MV 反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體積20μL，37℃1 h；70℃10 min。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用P1、P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.6 鹽脅迫處理

將轉(zhuǎn)基因植株和野生型的種子直接播種于混合介質(zhì)中，用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液定期澆灌。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含5棵植株，于8 h光照、16 h黑暗的短日照條件下培養(yǎng)，以促進(jìn)其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。

培養(yǎng)28 d后，分別用0、100、150、200 mmol／L Na Cl處理。Na Cl的濃度逐漸增加，每隔一天處理一次，每次處理增加50 mmol／L，待一起達(dá)到處理終濃度后，隔一天再繼續(xù)用終濃度處理7 d，對(duì)照澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。

觀察植株的生長(zhǎng)情況，分別取其地上部和根用于干、鮮重及離子含量的測(cè)定。

1.2.7 干、鮮重的測(cè)量

收取整株植株，用蒸餾水和去離子水將其沖洗干凈，用吸水紙吸干其表面水分，并將其小心分成根和地上部分，測(cè)量鮮重。之后放入烘箱中，120℃烘烤30 min，再在80℃烘烤48 h至恒重，稱(chēng)量干重。

1.2.8 Na＋、K＋離子含量的測(cè)定

將上述烘干至恒重的干材料碾磨成粉末，取一定量的粉末，用8 mL 65%濃硝酸和3 mL 30%雙氧水消解樣品，過(guò)濾后定容至50 mL，取部分樣品溶液用i CAP等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定K＋、Na＋含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及遺傳分析

將轉(zhuǎn)基因擬南芥T0、T1、T2、T3代種子在含30 mg／L潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選，得到轉(zhuǎn)Lg SOS1植株，對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定和耐鹽性分析。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

以野生型擬南芥的DNA作對(duì)照，用Lg SOS1特異性引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知：現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株中都可以擴(kuò)增出大小約為1800 bp左右的目的條帶，與預(yù)期的片段大小相吻合，而對(duì)照植株沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶，這表明目的基因的確已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的RT－PCR鑒定

提取經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株及對(duì)照植株的總RNA，進(jìn)一步作RT－PCR鑒定，轉(zhuǎn)化植株中Lg SOS1基因的表達(dá)情況見(jiàn)圖2。

圖2顯示：轉(zhuǎn)化植株中Lg SOS1基因已經(jīng)正常轉(zhuǎn)錄，野生型擬南芥沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增條帶，說(shuō)明在轉(zhuǎn)化植株中Lg SOS1基因已在轉(zhuǎn)錄水平上得到了表達(dá)。

圖1 轉(zhuǎn)LgSOS1植株的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of LgSOS1 in wild type and transgenic plants

圖2 轉(zhuǎn)LgSOS1植株的RT－PCR鑒定Fig.2 RT－PCR identification of LgSOS1 in wild type and transgenic plants

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性分析

2.4.1 轉(zhuǎn)基因植株在不同鹽脅迫處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)情況

分別用不同濃度的Na Cl處理野生型和轉(zhuǎn)基因植株，其生長(zhǎng)情況如圖3所示。

由圖3可見(jiàn)：轉(zhuǎn)基因植株在0 mmol／L Na Cl中的生長(zhǎng)與野生型植株沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明外源基因的插入和表達(dá)沒(méi)有影響植物正常的生長(zhǎng)。在不同濃度NaCl處理下，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)都受到抑制，但轉(zhuǎn)基因植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯好于野生型。

圖3 野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株在0，100，150，200 mmol／L Na Cl處理后的生長(zhǎng)比較Fig.3 Comparing the growth of wild type plants and transgenic plants with 0，100，150，200 mmol／L Na Cl treat ment

2.4.2 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株鮮重和干重的影響

結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知：在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株地上部分和根的鮮重以及干重與野生型植株一樣均下降，當(dāng)NaCl濃度達(dá)150～200 mmol／L時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株地上部分鮮重顯著高于野生型，而根的鮮重與對(duì)照差異未達(dá)到顯著水平；在同樣NaCl濃度下，轉(zhuǎn)基因植株地上部分干重與對(duì)照差異未達(dá)到顯著水平，但根的干重卻顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。

圖4 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株鮮重和干重的影響Fig.4 Effect of Na Cl treatment on the fresh weight and dry weight of transgenic plants and wild plants

2.4.3 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株Na＋、K＋含量的影響

結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5顯示：與0 mmol／L Na Cl處理相比較，在不同濃度NaCl處理?xiàng)l件下，野生型和轉(zhuǎn)基因植株地上部分的Na＋含量均有所增加。在100 mmol／L Na Cl條件下，與野生型對(duì)照相比，差異不明顯；在150～200 mmol／L Na Cl條件下，轉(zhuǎn)基因植株中Na＋含量顯著低于野生型（P＜0.05），而野生型和轉(zhuǎn)基因植株的K＋含量均有所減少。在不同濃度NaCl處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因植株地上部分的K＋含量與對(duì)照的差異達(dá)到顯著和極顯著水平（200 mmol／L）。

圖5 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株Na＋、K＋含量的影響Fig.5 The Na＋ （A）、K＋ （B）contents of wild type plants and the transgenic plants under different concentration of NaCl treatment

3 討論

高等植物的排Na＋機(jī)制主要與質(zhì)膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)［15］。SOD2過(guò)量表達(dá)的擬南芥在鹽脅迫下降低細(xì)胞內(nèi)Na＋含量，并顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性［16］。Hamada A等從藍(lán)藻中克隆了編碼質(zhì)膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Syn Nhap，明確其在Na＋運(yùn)輸中起重要作用［17］。王姝杰等將藍(lán)藻質(zhì)膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Nhap轉(zhuǎn)入煙草，F(xiàn)1代轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性得到了顯著的提高［18］。

本研究將大葉補(bǔ)血草SOS1基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)后，Na Cl脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的長(zhǎng)勢(shì)好于野生型，并且轉(zhuǎn)基因植株的鮮重、干重均高于野生型，說(shuō)明鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株有較強(qiáng)的耐鹽表型，保持了良好的長(zhǎng)勢(shì)。另外，Na＋和K＋含量分析表明，150～200 mmol／L Na Cl條件下轉(zhuǎn)基因植株地上部分Na＋含量顯著低于野生型（P＜0.05），說(shuō)明在鹽脅迫下SOS1將Na＋轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，與植物的耐鹽性直接相關(guān)。

盡管轉(zhuǎn)基因植株和野生型的K＋含量均明顯下降，但轉(zhuǎn)基因植株K＋含量下降幅度卻顯著低于野生型。這可能是野生型植株細(xì)胞中過(guò)多的Na＋干擾了細(xì)胞對(duì)K＋的營(yíng)養(yǎng)吸收，而轉(zhuǎn)基因植株中可能通過(guò)催化Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜運(yùn)輸將Na＋排出細(xì)胞外，從而維持細(xì)胞內(nèi)低鈉高鉀的生理環(huán)境，發(fā)揮了該基因的耐鹽性。在200 mmol／L NaCl處理?xiàng)l件下，1周后有部分野生型植株出現(xiàn)白化及死亡現(xiàn)象，可能是因?yàn)榧?xì)胞中Na＋積累過(guò)多，引起了次級(jí)氧化脅迫，對(duì)植物體造成了過(guò)多的傷害，從而引起植株白化死亡。

本研究結(jié)果表明：過(guò)量表達(dá)Lg SOS1基因的擬南芥比野生型具有較強(qiáng)的耐鹽能力，表明Lg SOS1在鹽脅迫下參與了轉(zhuǎn)基因植株Na＋的外排。Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在耐鹽中具有重要作用，隨著編碼Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的發(fā)現(xiàn)及對(duì)其作用機(jī)制了解的加深，人們將進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能特征及其信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)途徑，有望在作物耐鹽的研究方面取得重要突破，在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用方面真正做出貢獻(xiàn)。

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Influence on Salt Tolerance of Arabidopsis thaliana by Overexpressing LgSOS1

ZHOU Lingling，ZHU Jianbo，WANG Aiying
（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi，832003）

The cDNAs of Lg SOS1（Gen Bank aceession No.EU780458），a plasma membrane Na＋／H＋antiporter gene Lg SOS1 separated from halophyte Limonium gmelinii （Wildl.）Kuntze，were inserted into plant vector pCA MBIA1301.Arabidopsis thaliana wild－type（WT）plants were trans for med with Agrobaterium tumefaciens containing the resultant vectors under the control of Ca MV 35S promoter，and hygro mycin－resistant plants were obtained.PCR analysis indicated that Lg SOS1 gene was integrated into the genome of Arabidopsis.RT－PCR analysis revealed that transgenic plants over－expressed the Lg SOS1 in the transcript levels.Salt stress assay showed that the transgenic plants grew more vigorously than wild－type plants.It was implied by salt contents measure analysis that，compared with WT Plants，Na＋accumulation was remarkably lower and the K＋level was obviously higher in transgenic plants under severe salt stress（150～200 mol／L NaCl）.These results showed that Lg－SOS1－overexpression improved salt tolerance of Arabidopsis transgenic plants.

Lg SOS1 gene；plasma membrane Na＋／H＋antiporter；Arabidopsis thaliana；salt tolerance

TB332

A

1007－7383（2011）06－0731－06

2011－08－23

國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（2011ZX080052004），石河子大學(xué)高層次人才啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX200903）

周玲玲（1966－），女，副教授，從事植物基因工程研究；e－mail：Linglingzh＠shzu.edu.cn。