Acetobacter xylinumNUST4.2搖瓶發(fā)酵細菌纖維素的動力學研究

殷智超，馬 波，朱春林，孫東平

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實訓中心，安徽六安237012；3.南京理工大學化工學院，江蘇南京 210094）

AcetobacterxylinumNUST4.2搖瓶發(fā)酵細菌纖維素的動力學研究

殷智超1，2，馬 波3，朱春林3，孫東平3

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實訓中心，安徽六安237012；3.南京理工大學化工學院，江蘇南京 210094）

研究了細菌纖維素生產(chǎn)菌株AcetobacterxylinumNUST4.2的發(fā)酵動力學特性，建立了基于Logistic方程的菌體生長動力學、產(chǎn)物生成動力學、底物消耗動力學，得到了描述搖瓶發(fā)酵過程的動力學模型及模型參數(shù)，模型與實驗數(shù)據(jù)擬合良好，反映了該菌株分批發(fā)酵過程的動力學特征。

AcetobacterxylinumNUST4.2；細菌纖維素；發(fā)酵動力學模型

細菌纖維素（BC）是由某些微生物合成得到的超純纖維素，由D－葡萄糖以β－1，4糖苷鍵連接而成的鏈狀多糖高分子，具有（C6H10O5）n的組成［1］。與植物纖維素相比，BC具有純度高、結(jié)晶度高、重合度高、吸水性強、抗張強度好、生物適應(yīng)性強等獨特的性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)學、造紙、聲學器材、化妝品、三次采油、膜濾器、環(huán)保紙杯等領(lǐng)域［2］［3］。

發(fā)酵動力學主要是研究發(fā)酵過程中諸如菌體濃度、底物濃度、產(chǎn)物濃度等狀態(tài)變量隨時間的變化規(guī)律及其控制變量（溫度、pH值和溶氧等）之間的關(guān)系。數(shù)學模型的建立能夠以簡化的形式表征發(fā)酵過程行為，可用于進行工藝優(yōu)化和計算機模擬，檢測出可能重要但被忽視了的參數(shù)，并且有助于闡明反應(yīng)機理和代謝過程。本文構(gòu)建了AcetobacterxylinumNUST4.2搖瓶發(fā)酵細菌纖維素的動力學模型。

1 材料與方法

1.1 菌種

AcetobacterxylinumNUST4.2由本實驗室篩選并保藏。

1.2 試劑

斜面培養(yǎng)基（w／v）：葡萄糖3.0%，蛋白胨1.0%，檸檬酸0.115%，磷酸氫二鈉0.27%，硫酸鎂0.025%，瓊脂1.8%，自來水定容，調(diào)節(jié)pH至6.0。

種子培養(yǎng)基（w／v）：葡萄糖2.0%，玉米漿0.6%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.04%，硫酸銨0.6%，自來水定容，調(diào)節(jié)pH至6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（w／v）：葡萄糖1.8%，蔗糖2.1%，玉米漿2.0%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.04%，自來水定容，調(diào)節(jié)pH至6.0。

纖維素酶液：取1g纖維素酶（國藥集團化學試劑有限公司）用0.1mol／L pH4.8檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液溶解，定容至100ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 培養(yǎng)方法

由斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)活化好的菌種接入種子培養(yǎng)基，29℃、120r／min搖床振蕩培養(yǎng)18h，然后以8%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，29℃、120r／min搖床振蕩培養(yǎng)6d。

1.4 分析方法

1.4.1 菌濃測定

取發(fā)酵液10mL，加入10mL纖維素酶液，40℃振蕩水解2h。靜置取上清液，均分為2份，其中一份以0.22μm的微孔過濾器過濾除菌作為空白對照，在600nm處測吸光度。

1.4.2 殘?zhí)菧y定

采用改進的3，5－二硝基水楊酸（DNS）比色法測定［4］。

1.4.3 產(chǎn)量測定

收獲產(chǎn)物，3000r／min離心，水洗2次產(chǎn)物，然后浸泡于4%（w／w）NaOH溶液中80℃水浴保溫2h，再用水洗滌至pH為中性，置于80℃烘箱中烘干至恒重，室溫冷卻稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長細菌纖維素發(fā)酵過程的參數(shù)變化

AcetobacterxylinumNUST4.2發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素過程中菌體濃度、殘?zhí)菨舛?、細菌纖維素產(chǎn)量的變化見圖1所示。

圖1 細菌纖維素發(fā)酵過程的參數(shù)變化

2.2 菌體生長模型

由圖1可以看出，微生物的生長呈現(xiàn)明顯的S型，因此，采用Logistic方程來擬合菌體的生長。Logistic方程是典型的S型曲線，在描述微生物生長方面被廣泛應(yīng)用，效果較好。Logistic方程可以很好的擬合出微生物生長過程的遲滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期［5］。Logistic方程微分形式如下：

其中，X為菌體濃度，Xm為最大菌體濃度，μm為菌體細胞的最大比生長速率，t為時間。

Logistic方程的設(shè)計思想是比生長速率μ＝dX／（X·dt）隨菌體濃度X的增大而減小，因為微生物的生長條件有限，菌體濃度越大，微生物個體對限制性底物的競爭必然越激烈，導致比生長速率的減小，當菌體濃度達到一定值，這種競爭達到最大，比生長速率降至0，表現(xiàn)為微生物生長穩(wěn)定期。由Logistic方程可以看出，發(fā)酵初期，菌體濃度X遠遠小于Xm，因此X／Xm項忽略不計，此時菌體呈對數(shù)生長；而發(fā)酵后期，菌濃達最大值，為Xm，此時方程表示的生長速率為0，即，菌生長至穩(wěn)定期。

對式（1）進行積分，得到：

其中，X0為初始菌濃。

用GraphPad Prism軟件按式（2）對圖1中的菌濃（即：600nm下降解了細菌纖維素的發(fā)酵液的吸光度值）進行擬合，結(jié)果見圖2和表1：

圖2 Logistic方程擬合Acetobacter xylinumNUST4.2生長曲線

由圖2可以看出，擬合值與實測值基本相符，變化趨勢一致。

表1 Logistic模型的參數(shù)估計值

表1中列出各參數(shù)的最佳擬合值、標準誤差和95%置信區(qū)間。

GraphPad Prism軟件還給出此擬合的決定系數(shù)R2為0.9925，說明擬合較好，Logistic方程能很好的模擬AcetobacterxylinumNUST4.2發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素的菌體生長過程。

將表1中的參數(shù)估計值代入式（2），得到細菌纖維素發(fā)酵的AcetobacterxylinumNUST4.2菌體濃度隨時間的變化關(guān)系式：

2.3 產(chǎn)物生成模型

AcetobacterxylinumNUST4.2發(fā)酵的產(chǎn)物生成模型采用Luedeking－Piret方程，其表達式為：

其中，P為產(chǎn)物濃度；α，β為常數(shù)。

Luedeking－Piret方程概括了伴隨著菌體生長和獨立于菌體生長之外兩部分的產(chǎn)物生成速率。

將式（1）和（2）代入式（4）并積分得：

代入t0時刻的產(chǎn)量P0＝0，以及2.2中得到的擬合參數(shù)值：Xm＝0.3441，μ＝0.07378，X0＝0.003738，得：

用GraphPad Prism軟件按式（6）對圖1中測得的產(chǎn)量數(shù)據(jù)進行擬合，結(jié)果見圖3和表2。

圖3 Luedeking－Piret方程擬合產(chǎn)細菌纖維素曲線

由圖3中的擬合曲線可以看出，發(fā)酵初期沒有細菌纖維素生成，在AcetobacterxylinumNUST4.2生長約24h后才有產(chǎn)物合成，擬合曲線在縱坐標零點以下的部分應(yīng)當舍去，因發(fā)酵的產(chǎn)量不可能為負值。

表2 Luedeking－Piret模型的參數(shù)估計值

表2給出了產(chǎn)物生成模型中各參數(shù)的最佳擬合值、標準誤差和95%置信區(qū)間。最佳擬合的α，β值均不為0，說明AcetobacterxylinumNUST4.2發(fā)酵細菌纖維素的產(chǎn)物形成過程為生長部分偶聯(lián)型，這一點從圖3也可以看出，產(chǎn)物在微生物生長到一定階段時開始隨微生物的生長而生成。

軟件分析給出擬合曲線的決定系數(shù)R2＝0.9937，說明預(yù)測值與實驗值擬合的良好，Luedeking－Piret方程運用得當。

將表2中得到的參數(shù)估計值代入式（6）中，得到細菌纖維素的生成隨時間的變化關(guān)系式：

其中，當P＞0時，方程有實際意義。

2.4 底物消耗模型

AcetobacterxylinumNUST4.2發(fā)酵的底物消耗模型采用類似Luedeking－Piret模型，認為限制性底物葡萄糖的消耗分為三部分：菌體生長、產(chǎn)物合成和細胞內(nèi)源維持?；|(zhì)消耗的模型表達式：

其中，S為限制性底物葡萄糖濃度，Yx／s為菌體對底物的得率系數(shù)；Yp／s為產(chǎn)物對底物的得率系數(shù)；m為細胞維持系數(shù)。

將式（1）、式（2）和式（4）代入模型（8），得：

代入相關(guān)數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism軟件按式（13）對圖1中測得的殘?zhí)菨舛冗M行擬合，結(jié)果見圖4和表3：

圖4 限制性底物葡萄糖的消耗擬合曲線

由圖4看出，限制性底物的消耗基本符合模型假設(shè)，在菌體生長和產(chǎn)物生成速率較高的時候，葡萄糖的消耗速率也相應(yīng)較高。

表3 基質(zhì)消耗模型的參數(shù)估計值

表3給出了基質(zhì)消耗模型中各參數(shù)的最佳擬合值、標準誤差和95%置信區(qū)間。

軟件分析給出擬合曲線的決定系數(shù)R2＝0.9801，說明預(yù)測值與實驗值擬合的良好，基質(zhì)消耗模型的選取是合適的。

將表3中得到的參數(shù)估計值代入式（13）中，得到限制性基質(zhì)葡萄糖隨時間的變化關(guān)系式：

3 結(jié)論

在本實驗室自行優(yōu)化的穩(wěn)定發(fā)酵條件下構(gòu)建出了AcetobacterxylinumNUST4.2搖瓶發(fā)酵細菌纖維素的動力學模型。

菌體生長模型：

產(chǎn)物生成模型：

［1］Vandamme E J，De Baets S，Vanbaelen A，et al.Improved Production of Bacterial Cellulose and Its Application Potential［J］.Polymer Degradation and Stability，1998，59：93－99.

［2］Jonas R，F(xiàn)arah L F.Production and Application of Microbial Cellulose［J］.Polym Degrad Stab，1998，59（1）：101－106.

［3］Klemm D，Schumann D，Udhardt U，et al.Bacterial Synthesized Cellulose——Artificial Blood Vessels for Microsurgery［J］.Prog Polym Sci，2001，26（19）：1561－1603.

［4］Zhou L L，Sun D P，Hu L Y，et al.Effect of Addition of Sodium Alginate on Bacterial Cellulose Production by Acetobacter xylinum［J］.Journal of Industrial Microbiology ＆Biotechnology，2007，34：483－489.

［5］Kaushik Nath，Manoj Muthukumar，Anish Kumar，et al.Kinetics of Two－stage Fermentation Process for the Production of Hydrogen［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33：1195－1203.

Studies on Fermentation Kinetics of Acetobacter xylinumNUST4.2 Producing Bacterial Cellulose in Shake Flask

YIN Zhi－chao1，2，MA Bo3，ZHU Chun－lin3，SUN Dong－ping3

（1.CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEengineering，WesternAnhuiUniversity，Lu’an237012，China；2.AnhuiProvincePlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012China；3.SchoolofChemicalEngineering，NanjingUniversityofScienceandTechnology，Nanjing210094，China）

The fermentation kinetics of bacterial cellulose－producting strain Acetobacter xylinum NUST4.2was studied.A kinetic model was established based on the Logistic equation for cell growth，product formation and substrate consumption during fermentation in shake flask.The model fitted well and gave a reasonable description of the batch fermentation process.

Acetobacter xylinum NUST4.2；bacterial cellulose；fermentation kinetics model

Q815

A

1009－9735（2011）05－0088－04

2011－10－01

安徽省教育廳自然科學基金重點項目資助（KJ2010A328，KJ2011A272）。

殷智超（1987－），女，安徽金寨人，皖西學院生物與制藥工程學院助教，碩士，研究方向：微生物發(fā)酵。