皖貝母內(nèi)生真菌的初步研究

楊 宇，汪學(xué)軍，韋傳寶，2，余茂耘，吳琪瑤

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽六安237012；3.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230039）

皖貝母內(nèi)生真菌的初步研究

楊 宇1，汪學(xué)軍1，韋傳寶1，2，余茂耘1，吳琪瑤3

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽六安237012；3.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230039）

采用平板分離法從皖貝母新鮮鱗莖、莖桿和葉中分離出2種內(nèi)生真菌（A1和B1），通過(guò)菌落形態(tài)和ITS序列確定內(nèi)生菌的種屬，通過(guò)DNAMAN軟件多重序列比對(duì)確定與其他真菌的同源關(guān)系。結(jié)果表明，A1歸為被孢霉屬，與Mortierella elongata的ITS序列同源性高達(dá)99.44%；另一種歸為青霉屬，與Penicillium janthinellum的ITS序列同源性高達(dá)98.65%。

皖貝母；內(nèi)生真菌

內(nèi)生菌（endophyte）是指在其生活史的某一階段或整個(gè)時(shí)期生活于植物組織器官內(nèi)部，而不引起被浸染的宿主植物發(fā)生明顯性狀改變的菌類，主要包括真菌、放線菌和細(xì)菌。研究表明，某些內(nèi)生菌能夠促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的合成，并且具有與宿主植物相似的代謝途徑，產(chǎn)生相同的活性次生代謝產(chǎn)物［1］。因此，植物內(nèi)生菌作為新的微生物資源受到廣泛關(guān)注。

皖貝母（Fritillaria anthuiensis S.C.Chen et S.F.Yin）屬于百合科（Liliaceae）貝母屬（Fritillaria L.）藥用植物［2］，在安徽省種植較多，是安徽省名貴中藥材［3］，可用于治療急、慢性支氣管炎等疾?。?］。目前，對(duì)貝母屬植物內(nèi)生菌的研究很少，國(guó)內(nèi)僅葉波平等從浙貝母［5］、祝興偉等從伊犁貝母［6］中分離出內(nèi)生真菌。本文以皖貝母新鮮鱗莖、莖桿和葉為材料，分離其內(nèi)生菌，通過(guò)測(cè)定其ITS序列鑒定其種屬，通過(guò)DNAMAN軟件多重序列比對(duì)確定與其他真菌的同源關(guān)系，為研究皖貝母內(nèi)生菌奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從安徽省霍山縣采集健康的皖貝母鱗莖備用。

1.2 方法

1.2.1 皖貝母內(nèi)生真菌的分離與保藏

在無(wú)菌條件下將皖貝母鱗莖表面清洗干凈，晾干后用75%酒精浸泡1.5min，無(wú)菌水沖洗1次，10%次氯酸鈉溶液浸泡5min，無(wú)菌水沖洗1次，再用75%酒精浸泡30s，無(wú)菌水沖洗干凈。將鱗莖切割成0.5× 0.5cm2的塊狀，截面向下置于含青霉素的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000ml，pH自然），最后一次沖洗液作為對(duì)照。28℃條件下培養(yǎng)，觀察期間菌落形態(tài)、顏色等特征，將形態(tài)、顏色不同的菌落轉(zhuǎn)接到新的固態(tài)培養(yǎng)基上，編號(hào)，28℃培養(yǎng)3～7d，放入4℃冰箱保存。

1.2.2 皖貝母內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)觀察及初步分類

觀察并記錄各菌落的形態(tài)。參照沈萍等透明膠帶法［7］（P74）制作臨時(shí)裝片，用低倍鏡、高倍鏡進(jìn)行鏡檢，并置于油鏡下觀察、拍照保存。

1.2.3 皖貝母內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定

選擇不同形態(tài)的真菌進(jìn)行ITS序列測(cè)序，每種真菌獨(dú)立測(cè)定3株，由上海生工生物工程有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行Blast分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定內(nèi)生菌的種屬；通過(guò)DNAMAN軟件將ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣種序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，用DNAMAN軟件中Observe Divergency方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 皖貝母內(nèi)生真菌的分離與保藏

從皖貝母鱗莖、莖桿和葉中共發(fā)現(xiàn)2種不同形態(tài)的真菌，分別標(biāo)號(hào)A、B，每種選擇3株保存，分別標(biāo)號(hào)A1、A2、A3、B1、B2和B3。

2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)觀察

A1、A2和A3形態(tài)一致，毛氈狀，表面灰綠色，附著絮狀絨毛，背面暗黃色，孢子為孢囊孢子，孢囊梗呈伸長(zhǎng)絲狀，幾乎不分枝，孢子囊頂生球形，以A1作為代表，形態(tài)見(jiàn)圖1。B1、B2和B3形態(tài)一致，白色，毛氈狀，有輻射狀褶皺，附著絮狀絨毛，背面略呈橘黃色，孢子為分生孢子，孢子梗分生呈掃帚狀，孢子球形串生，以B1作為代表，形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖1 A1孢囊孢子、孢囊及孢囊梗

圖2 B1分生孢子及孢子梗

2.3 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定

測(cè)序結(jié)果顯示A1、A2和A3序列相同，以A1作為代表；B1、B2和B3序列相同，以B1作為代表。序列經(jīng)同源序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與A1的ITS序列同源性最高的4株為Mortierella屬；與B1的ITS序列同源性最高的4株為Penicillium屬。使用DNAMAN軟件中Observe Divergency方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明：A1的ITS序列與GenBank中12個(gè)近緣種（表1）序列同源性為65.67%～99.44%，其中Mortierella elongata與A1的ITS序列同源性高達(dá)99.44%，Mortierella indohii與A1的ITS序列同源性最低，為65.67%（圖3）。B1的ITS序列與GenBank中17個(gè)近緣種（表2）序列同源性為80.36%～98.65%，其中Penicillium janthinellum與B1的ITS序列同源性高達(dá)98.65%，Penicillium purpurogenum與B1的ITS序列同源性最低，為80.36%（圖4）。

表1 A1與12個(gè)近緣種Genbank登錄號(hào)及拉丁名

表2 B1與17個(gè)近緣種Genbank登錄號(hào)及拉丁名

圖3 A1的ITS序列與GenBank中12個(gè)近緣種序列同源進(jìn)化分析

圖4 B1的ITS序列與GenBank中17個(gè)近緣種序列同源進(jìn)化分析

3 討論

從現(xiàn)有的研究結(jié)果來(lái)看，貝母類植物內(nèi)生菌種類較多，而且分屬于不同的科屬。祝興偉等人從伊犁貝母中分離的內(nèi)生菌尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum Y1屬于鐮刀霉屬［6］；葉波平等人從浙貝母中分離的內(nèi)生菌Nectria sp.JZ6屬于叢赤殼屬［5］；本文從皖貝母中分離的內(nèi)生菌長(zhǎng)被孢霉屬于被孢酶科，被孢霉屬成員；而另一種內(nèi)生菌微紫青霉屬于曲霉科，青霉屬成員。長(zhǎng)被孢霉因其含有豐富的γ－亞麻酸（GLA）、花生四烯酸（ARA）［8］，二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），廣泛被研究用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，東京大學(xué)農(nóng)化系已從長(zhǎng)被孢霉IS－4獲得了500mg／L EPA的產(chǎn)量［9］；微紫青霉對(duì)重金屬離子有較強(qiáng)的吸附能力，可用于重金屬污水的處理［10］［11］；本文分離的長(zhǎng)被孢霉和微紫青霉是否有這些功能尚待進(jìn)一步研究。

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［4］李成網(wǎng)，李清華.薄層掃描法測(cè)定皖貝精膠囊貝母素甲的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2001，7（3）：21－22.

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A Preliminary Study on Endophytic Fungi from Fritilaria anhuiensis

YANG Yu1，WANG Xue－jun1，WEI Chuan－bao1，2，YU Mao－yun1，WU Qi－yao3

（1.CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEengineering，WesternAnhuiUniversity，Lu’an237012，China；2.AnhuiProvincePlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012，China；3.CollegeofLifeScience，AnhuiUniversity，Hefei230039，China）

Two kinds of endophytic fungi（named A1and B1）were separated from fresh Fritilaria anhuiensis bulb，stem and leaf by culture dish.Their taxonomy were determined by morphology analysis and ITS analysis.The relationship with other fungi were determined by DNAMAN analysis.The results indicated that A1belongs to genus Mortierella and shared 99.44%nucleotide acid identities with Mortierella elongata ITS.B1belongs to genus Penicillium and shared 98.65%nucleotide acid identities with Penicillium janthinellum ITS.

Fritilaria anhuiensis；endophytic fungi

Q939.95

A

1009－9735（2011）05－0008－03

2011－10－01

安徽省教育廳自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助（KJ2010A328，KJ2011A272）。

楊宇（1989－），男，安徽安慶人，研究方向：分子生物學(xué)。

韋傳寶（1961－），男，安徽壽縣人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物病毒。