莓葉委陵菜黃酮與三萜類成分提純與HPLC條件的初步研究

閔運(yùn)江，張正喜

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽六安 237012）

莓葉委陵菜黃酮與三萜類成分提純與HPLC條件的初步研究

閔運(yùn)江1，2，張正喜1

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽六安 237012）

在適宜的工藝條件下，即采70%乙醇，料液比為1：25，5次回流，水浴回流時(shí)間為2h，對(duì)莓葉委陵菜（Potentillafragarioides）中黃酮類、三萜類化合物進(jìn)行了粗提取，經(jīng)大孔樹脂純化，得到精制黃酮類、三萜類化合物溶液。然后探究其高效液相色譜分析的條件并在此條件下進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明：在流動(dòng)相為乙腈和0.2%冰醋酸（體積比60：40），流量為1.0mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm的色譜條件下，樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰均較好，且峰形對(duì)稱，蘆丁和熊果酸有不同的Rf值，說(shuō)明兩者在此條件下可以很好的分離。該方法測(cè)定簡(jiǎn)便，分離效果好，重復(fù)性好，靈敏度高。

莓葉委陵菜；黃酮類化合物；三萜類化合物；高效液相色譜；提取與純化

莓葉委陵菜（PotentillafragarioidesL.）又名雉子筵，系薔薇科委陵菜屬（PotentillaL.）多年生草本植物，為中藥雉子筵的基源植物，根及全草藥用，其性甘、溫，益中氣，補(bǔ)陰虛，有清熱解毒，止血止痢等作用；內(nèi)服治痢疾，外用治疥瘡；制劑雉子筵止血片，臨床用于子宮肌瘤出血，月經(jīng)過(guò)多，功能性子宮出血，產(chǎn)后出血等；根含α－兒茶素等鞣質(zhì)，可提制栲膠［1］（P75－76）［2］（P393－394）［3］。委陵菜屬植物中含有黃酮、三萜類等生物活性成分［4－8］。黃酮類化合物廣泛分布于植物界，是泛指兩個(gè)苯環(huán)（A與B環(huán)）通過(guò)三個(gè)碳原子相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物，其基本的碳架為C6－C3－C6。其具有諸多藥理作用，在心腦血管的保健、更年期綜合癥的治療等方面均有顯著的療效，因此受到廣泛重視［9］［10］。萜類化合物廣泛存在于動(dòng)植物體中，如植物香精油、植物及動(dòng)物的某些色素等，它們的共同點(diǎn)是分子中的碳原子數(shù)都是5的倍數(shù)，三萜是由六個(gè)異戊二烯單位以頭尾相連結(jié)合而成的。它具有許多生理活性，有保肝排毒、抗氧化、抗菌消炎、抗HIV－1等作用［11］［12］。

莓葉委陵菜自然分布廣，資源豐富，且因其根系發(fā)達(dá)而易繁殖栽培，其葉叢繁茂，花色鮮黃而艷麗，在城市園林綠化中，值得推廣使用。然而，莓葉委陵菜中的黃酮類和三萜類等生物活性成分的研究尚未見報(bào)導(dǎo)。

目前，對(duì)黃酮類、三萜類的分析方法主要有分光光度法、高效液相色譜法（HPLC法）、液相色譜－質(zhì)譜法（LC／MS法）、毛細(xì)管電泳法（MECC法）、氣相色譜法（GC法）和薄層掃描法（TLC法）等［13］。分光光度法測(cè)定三萜化合物含量基于三萜苷元和香草醛的顏色反應(yīng)，缺點(diǎn)是樣品中如含有C3位羥基的甾醇和膽酸等同樣也可能產(chǎn)生顏色反應(yīng)，易引起誤差；LC／MS法和MECC法測(cè)定需要的儀器復(fù)雜；GC法需要對(duì)待測(cè)組分衍生化才能檢測(cè)，在使用上都受到一定的限制；薄層掃描法主要問(wèn)題是所有檢測(cè)樣品的平衡性；本文采用HPLC法同時(shí)對(duì)莓葉委陵菜中黃酮類、三萜類進(jìn)行定性、定量分析，方法快速、簡(jiǎn)便、可靠，可為莓葉委陵菜藥用產(chǎn)品的開發(fā)及質(zhì)量評(píng)定提供較實(shí)用的方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

莓葉委陵菜（PotentillafragarioidesL.）采自六安市小華山陽(yáng)坡荒地，洗凈后100℃烘箱干燥，常溫儲(chǔ)藏，備用。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：Waters1525高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測(cè)器，KF－C18系列色譜柱（中科院大連化學(xué)物理研究所），手動(dòng)進(jìn)樣器，F(xiàn)A1004電子天平（上海精科天平），101AS－2型不銹鋼數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠），RE－52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海浦滬儀器廠），KQ－500B型超聲波清洗器，HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（40目，浙江省上虞縣紗篩廠），AB－8型大孔吸附樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），索氏提取器，層析柱（15×200mm）等。

主要試劑：蘆?。≧utin，上海化學(xué)試劑公司），熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海時(shí)代生物科技有限公司），0.2%冰醋酸，乙腈等，其中乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 黃酮及三萜類成分的提取

1.3.1 樣品處理

稱取一定重量的莓葉委陵菜干樣品，將其剪碎置于研缽中研成粉末，過(guò)40目篩后收集粉末于烘箱中103℃烘至恒重，在干燥器中冷卻后備用。

1.3.2 脫脂

取莓葉委陵菜干粉用折成筒狀的濾紙包好，細(xì)線扎緊，封口處加少許脫脂棉，置于索式提取器的浸提管內(nèi)，濾紙包長(zhǎng)不超過(guò)虹吸管，索氏抽提法除去脂溶性雜質(zhì)，即以無(wú)水乙醚為脫脂劑，于45℃下脫脂20h，充分除去樣品中脂類和脂溶性色素。取出樣品濾紙包先用電吹風(fēng)吹干，再將濾紙包置烘箱中103℃烘2h后備用。

1.3.3 浸提

稱取脫脂后干粉一定量，置于三角燒瓶中加入70%乙醇回流提取總黃酮和三萜類，第一次浸提加入干粉重量50倍體積的70%乙醇，即固液比＝1：50，以后每次浸提固液比＝1：25，第一次浸提時(shí)間為3h，以后每次浸提時(shí)間為2h，浸提溫度為70℃，直到乙醇浸提液基本無(wú)色，共浸提5次，每次浸提液均經(jīng)漏斗濾紙過(guò)濾至三角燒瓶?jī)?nèi)，合并5次提取液，將粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去其中乙醇并對(duì)乙醇進(jìn)行回收，蒸去乙醇后的粗提物水溶液保存待用。

1.4 黃酮、三萜類的純化

1.4.1 大孔樹脂預(yù)處理

用40目篩在水中篩選出大小合適，顆料均勻的樹脂，先用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇充分浸泡24h后裝柱，然后用95%乙醇洗至洗出液加適量水無(wú)白色渾濁，再用去離子水洗至無(wú)醇味后加入大約4倍體積的5%HCl浸泡3－4h，用去離子水洗至中性，再加入大約4倍體積的5%NaOH浸泡3－4h，最后用去離子水洗至中性。

1.4.2 大孔樹脂裝柱

取層析柱（15×200mm），剪與柱口等面積的濾紙用水帶至柱底部，平蓋住底部的石英沙隔板，或是用脫脂棉用玻棒壓平蓋住底部，在柱中有一定量水的情況下擠出層析柱下端的空氣，大孔樹脂分散在水中用玻棒引流入柱中（裝柱150mm），注意柱子中水面要始終漫過(guò)大孔樹脂，否則柱中樹脂間會(huì)有氣泡，影響后來(lái)吸附效果。

1.4.3 粗提物純化

將粗提物水溶液調(diào)節(jié)pH至2，上柱的吸附速率為1.0mL／min，待吸附充分后，先用蒸餾水洗至無(wú)色，然后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫，洗脫速度1.0 mL／min，洗脫至無(wú)色，收集洗脫液即純化后精黃酮、三萜類的醇溶液，備用。

2 HPLC條件［14］［15］與檢測(cè)結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取蘆丁和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品適量，以乙睛－0.2%冰醋酸（60：40）溶解，于紫外分光光度計(jì)上在200－400nm進(jìn)行掃描，其中蘆丁的最大吸收峰280nm；熊果酸的最大吸收峰在205nm，并且在280nm和252nm分別有次吸收峰。因此，紫外吸收檢測(cè)波長(zhǎng)確定為280nm。

2.2 色譜條件

以乙腈－0.2%冰醋酸水溶液（60：40）為流動(dòng)相，1.0mL／min的流速，用KF－C18色譜柱，用Waters2487紫外檢測(cè)器在280nm波長(zhǎng)下分析檢測(cè)，柱溫為室溫。所有組分在20min內(nèi)出完。

2.3 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)待分析的理化性質(zhì)及參考文獻(xiàn)，本文選用乙腈－0.2%冰醋酸為流動(dòng)相，并且對(duì)兩液體的不同配比條件下的組分出峰情況進(jìn)行了反復(fù)對(duì)比研究，結(jié)果表明，在2.2項(xiàng)的色譜條件下，乙腈：0.2%冰醋酸水溶液＝60：40時(shí)，等度洗脫組分分離效果較好，樣液中的蘆丁峰和熊果酸峰與其它相鄰雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱（圖1－圖3），與同等色譜條件下測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰對(duì)照，保留時(shí)間分別是蘆丁為1.913min，熊果酸為2.092min。

圖1 精制莓葉委陵菜黃酮和三萜類HPLC圖譜

圖2 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁HPLC圖譜

圖3 標(biāo)準(zhǔn)熊果酸HPLC圖譜

3 分析與討論

3.1 定性、定量分析

根據(jù)HPLC的定性、定量分析的原理，在相同色譜條件下，保留時(shí)間相同的為同一物質(zhì)，而其峰面積比即是其含量比。因此，參照標(biāo)準(zhǔn)蘆丁、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，圖1中保留時(shí)間為1.913min的峰為蘆丁峰，保留時(shí)間為2.092min的峰為熊果酸峰，有較好的分離效果，基本上能與其周圍其他峰達(dá)到基線分離。

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

以配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，體積為10ul，分別含蘆丁1.0ug、熊果酸1.4ug，分別于上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定蘆丁、熊果酸的含量，記錄保留時(shí)間，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（見表1、表2），結(jié)果表明，保留時(shí)間與蘆丁的RSD以及熊果酸的RSD均在5%以下，表明在該實(shí)驗(yàn)條件下同一組分出峰時(shí)間有良好的重現(xiàn)性，說(shuō)明色譜條件適宜。

表1 蘆丁精密度實(shí)驗(yàn)

表2 熊果酸精密度實(shí)驗(yàn)

3.3 高效液相色譜中工作波長(zhǎng)的確定

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別以254nm、260nm、280nm、335nm、360nm的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，用280nm波長(zhǎng)檢測(cè)出峰效果較好。

3.4 高效液相色譜中流動(dòng)相的選擇

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選用了乙腈－0.2%冰醋酸等度洗脫如100：0、75：25、60：40、50：50和梯度洗脫幾種方式。結(jié)果表明，以2.3下系統(tǒng)較好。

本次研究對(duì)莓葉委陵菜中蘆丁和熊果酸進(jìn)行高效液相色譜條件的初步分析，從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，蘆丁和熊果酸雖有較好的峰分離，但測(cè)出的的含量均較低，明顯低于其他方法研究測(cè)得的含量［9］，因此色譜分析的條件還需要進(jìn)一步的深入研究探討。另外，雖然莓葉委陵菜在其他液相色譜條件下有不少色譜出峰，但各峰所代表的成分種類等都尚待進(jìn)一步研究。

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A Preliminary Study on the Extraction and Purification and HPLC Conditions of Flavonoids and Triterpene Compounds in Potentilla Fragarioides

MIN Yun－jiang，ZHANG Zheng－xi

（1.BiologicalandPharmaceuticalEengineeringCollege，WesternAnhuiUniversity，Lu’an237012，China；2.AnhuiPlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012，China）

In the optimum conditions，i.e.，70%ethanol was used，the ratio of material and liquid was 1：25，5times of the backflow，and the time of backflow was 2hours，the flavonoids and triterpene compounds in Potentilla fragarioides were extracted.The flavonoids and triterpene compounds solution were purified with macroporous resin.The conditions of high performance liquid chromatographic analysis（HPLC）were explored and then qualitative and quantitative analyses of the liquid samples were made under the HPLC conditions.The results showed that：The mobile phase were acetonitrile and 0.2%acetic acid and its volume ratio was 60：40，the flow rate was 1.0ml／min.The detection wavelength was 280nm.Under this chromatographic conditions，both the Rutin and Ursolic Acid in the sample solution and standard solution reached good HPLC peaks and these peaks were separated enough.So HPLC is a simple method which can make good separating effects，repeat and have high sensitivity.

Potentilla fragarioides L.；flavonoids；triterpene compounds；high performance liquid chromatography（HPLC）；extraction and purification

Q5－33

A

1009－9735（2011）05－0001－03

2011－10－01

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2010A327）；國(guó)家自然科學(xué)基金（41072251）。

閔運(yùn)江（1963－），男，安徽金寨人，博士，教授，研究方向：植物生態(tài)、植物資源開發(fā)。