?？芗?xì)胞素的生物信息學(xué)分析

陸 佳，肖 良，王倩倩，蔡濱欣，張黎明

(第二軍醫(yī)大學(xué) 海醫(yī)系 防化醫(yī)學(xué)教研室，上海 200433)

?？芗?xì)胞素的生物信息學(xué)分析

陸 佳，肖 良，王倩倩，蔡濱欣，張黎明

(第二軍醫(yī)大學(xué) 海醫(yī)系 防化醫(yī)學(xué)教研室，上海 200433)

利用生物信息學(xué)的軟件與方法對(duì)已報(bào)道的17種?？芗?xì)胞素的氨基酸組成、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征以及系統(tǒng)演化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明不同?？芗?xì)胞素在氨基酸組成和理化性質(zhì)上具有一定相似性，但其在結(jié)構(gòu)上有一定差別。以MP法和NJ法對(duì)不同海葵溶細(xì)胞素構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)基本一致，在親緣關(guān)系較近的7種海葵溶細(xì)胞素中可以找到6個(gè)保守序列。

?？?溶細(xì)胞素;生物信息學(xué)

海葵(Sea anemone)屬于腔腸動(dòng)物門(Coelenterata)珊瑚綱(Anthozoa)，是一類原始的多細(xì)胞動(dòng)物。?？舅厥且活惥哂腥苎?、細(xì)胞毒、心臟毒、膜去極化和鉀離子通道阻滯等生物毒性的多肽類毒素。溶細(xì)胞素是?？舅刂醒芯枯^為深入的一類活性組分［1-5］。本文擬利用生物信息學(xué)的軟件與方法對(duì)目前已報(bào)道的17種來(lái)源不同的?？芗?xì)胞素的氨基酸組成和序列、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征以及系統(tǒng)演化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，以期為深入開(kāi)展該類蛋白質(zhì)的相關(guān)研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

通過(guò)檢索，從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到Actinoporin Or-A等17種?？芗?xì)胞素作為分析對(duì)象(見(jiàn)表1)。

表1 17種?？芗?xì)胞素序列

利用BioEdit等多種生物信息學(xué)軟件(見(jiàn)表2)對(duì)17種海葵溶細(xì)胞素蛋白序列的氨基酸組成、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性及分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸組成、理化特性以及信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

分析發(fā)現(xiàn)不同?？芗?xì)胞素的氨基酸組成具有一定相似性(見(jiàn)表3):①非極性氨基酸以Gly、Ala、Leu和 Val等4種含量豐富;②極性氨基酸以Lys、Tyr和Ser等3種含量豐富。③Cys含量極低，除信號(hào)肽區(qū)域外該毒素中不含有Cys。

不同海葵溶細(xì)胞素理化性質(zhì)、信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域有如下特點(diǎn):①毒素相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)范圍15 000～29 800，長(zhǎng)度165～276個(gè)氨基酸，功能域長(zhǎng)度約170個(gè)氨基酸;②除Src I和RTX-SⅡ?yàn)樗嵝缘鞍淄?，其余毒素等電點(diǎn)均大于7，為堿性蛋白;③含有長(zhǎng)度約20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，部分含信號(hào)肽的毒素中含有長(zhǎng)約10～20個(gè)氨基酸的“Propeptide”序列;④除 Avt-1、EqTV、Src I、PsTX-20A 和 HMgⅢ這5 種海葵溶細(xì)胞素含有跨膜結(jié)構(gòu)外，其余12種溶細(xì)胞素不含跨膜結(jié)構(gòu)。

表2 主要分析軟件［6］

表3 ?？芗?xì)胞素的理化性質(zhì)、信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域的分析

2.2 不同?？芗?xì)胞素疏水性/親水性預(yù)測(cè)

海葵溶細(xì)胞素的疏/親水性有明顯差異，可分為3組:第1組包括Actinoporin Or-A等13種溶細(xì)胞素，其結(jié)構(gòu)中均有1個(gè)長(zhǎng)約30個(gè)氨基酸的疏水區(qū);第2組包括Avt-1、PsTX-20A和Bandaporin等3種，含有2個(gè)長(zhǎng)度均為25個(gè)氨基酸的疏水區(qū);第3組僅Echt 2這1種，含有2個(gè)長(zhǎng)度分別為50和25個(gè)氨基酸的疏水區(qū)域。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)海葵溶細(xì)胞素二級(jí)結(jié)構(gòu)相似性較高。如表4所示，除Echt2外，含量最多的是無(wú)規(guī)則卷曲，其次為β-折疊和α-螺旋，而Echt2中含量最高的是α-螺旋，其次為無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊。β-轉(zhuǎn)角散布于溶細(xì)胞素整個(gè)蛋白分子內(nèi)。

表4 不同?？芗?xì)胞素二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 不同?？芗?xì)胞素多重序列比對(duì)、分子進(jìn)化及保守序列的分析

對(duì)?？芗?xì)胞素進(jìn)行親緣分析，發(fā)現(xiàn)Actinoporin Or-A、Actinoporin Or-G、Bandaporin、EqTⅡ、EqTⅣ、EqTⅤ、Fra C、HMgⅢ、RTX-A、RTX-SⅡ、StⅠ、StⅡ、Tenebrosin-C 等 13 種毒素親緣關(guān)系較近，用MP法和NJ法分別構(gòu)建了分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)。

圖1 海葵溶細(xì)胞素系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

結(jié)果表明，不同的建樹(shù)方法，所建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)是相似的。根據(jù)NJ法的建樹(shù)結(jié)果，在Actinoporin Or-A、Actinoporin Or-G、HMgⅢ、RTX-A、RTX-SⅡ、StⅠ和 StⅡ等 7 種毒素中尋找保守序列，發(fā)現(xiàn)其含 VSRKIA、DNESGG、NAYFRSGTTDVILP、KALLY、YSNWW和RRADQ等6段保守序列(圖2)。

2.5 不同海葵溶細(xì)胞素空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

不同?？芗?xì)胞素在空間結(jié)構(gòu)上十分相似，多為β-折疊及α-螺旋兩者間以 β-轉(zhuǎn)角連接。其信號(hào)肽和“Propeptide”的序列多以α-螺旋形式存在，在毒素N端含有雙親螺旋，推測(cè)與結(jié)合膜蛋白發(fā)揮溶細(xì)胞毒性有關(guān)。

圖2 ?？芗?xì)胞素蛋白序列多重對(duì)比

3 討論

隨著傳統(tǒng)生物學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，生物信息學(xué)作為一門新興學(xué)科，在生物學(xué)各領(lǐng)域中越來(lái)越常用。雖然生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)的方法是建立在對(duì)大量已知數(shù)據(jù)的分析模擬基礎(chǔ)上的，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定的偏差，但在課題研究前期，生物信息學(xué)的方法對(duì)揭示生物分子自身所帶的信息、規(guī)律及生物大分子間的關(guān)系有重要作用［7］。本文主要利用生物信息學(xué)方法對(duì)已報(bào)道的17種?？芗?xì)胞素的氨基酸組成、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征以及系統(tǒng)演化關(guān)系等進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明，不同?？芗?xì)胞素在結(jié)構(gòu)上存在相似性，這樣的相似性是其具有相似毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)本文分析結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道可以看出，?？芗?xì)胞素為一類Mr約20 000的分泌蛋白，除個(gè)別為酸性蛋白外，多數(shù)為堿性蛋白;是一類真核生物膜孔道形成毒素(pore-forming toxin)，能夠與血細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血小板、纖維原細(xì)胞及人工脂膜相結(jié)合，在膜上形成直徑為1.0～2.0 nm的離子選擇性通道［8］。在膜孔形成的過(guò)程中，毒素的正電荷與磷脂雙分子層表面負(fù)電荷相互吸引靠近;毒素結(jié)構(gòu)中富含Lys、Tyr、Ser等極性氨基酸的區(qū)域與細(xì)胞膜結(jié)合，N端氨基酸形成的雙親螺旋區(qū)插入膜內(nèi)，達(dá)一定濃度后毒素蛋白即可結(jié)合形成三或四聚體形成陽(yáng)離子通道從而發(fā)揮毒性作用［9］。若切除毒素N端的氨基酸可發(fā)現(xiàn)隨著切除的氨基酸數(shù)目的增加，毒素蛋白的溶解性和溶血能力均降低，但其對(duì)鞘磷脂和血紅細(xì)胞的結(jié)合能力卻增強(qiáng)，說(shuō)明?？芗?xì)胞素保守的N端與該毒素蛋白的溶解性、膜孔形成有關(guān)，但并不是膜結(jié)合所必須的［10］。綜合上述分析，可以看出文獻(xiàn)已報(bào)道的研究結(jié)果和本文利用生物信息學(xué)方法分析的結(jié)果是吻合的，提示我們可以反過(guò)來(lái)運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析、預(yù)測(cè)的結(jié)果來(lái)指導(dǎo)具體的實(shí)驗(yàn)研究工作。在對(duì)海葵溶細(xì)胞素的分析中我們發(fā)現(xiàn)一些保守區(qū)域，這些保守區(qū)除短肽RGD已有相關(guān)研究報(bào)道外，其余均未見(jiàn)報(bào)道，這些信息對(duì)我們進(jìn)一步深入研究?？芗?xì)胞素的作用機(jī)制及相關(guān)防護(hù)措施和救治藥物具有一定指導(dǎo)意義。可以預(yù)測(cè)，隨著生物信息學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，利用生物信息學(xué)方法對(duì)生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析將會(huì)成為生物分子前期研究中常規(guī)的技術(shù)手段。

［1］Bellomio A，Morante K，Barlic A，et al.Purification，cloning and characterization of fragaceatoxin C，a novelactinoporin from the sea anemone Actinia fragacea［J］.Toxicon，2009，54(6):869-880.

［2］Uechi G，Toma H，Arakawa T，et al.Molecular cloning and functional expression of hemolysin from the sea anemone Actineria villosa［J］.Protein Expr Purif，2005，40(2):379-384.

［3］Monastyrnaya M M，Zykova T A，Apalikova O V，et al.Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus［J］.Toxicon，2002，40(8):1197-1217.

［4］Wang Y，Chua K L，Khoo H E.A new cytolysin from the sea anemone，Heteractis magnifica:isolation，cDNA cloning and functional expression［J］.Biochim Biophys Acta，2000，1478(1):9-18.

［5］劉 偉，王 娟，姜孝玉，等.?？芗?xì)胞素的研究進(jìn)展［J］.海洋科學(xué)，2005，29(4):56-62.

［6］張成崗，賀福初.生物信息學(xué)方法與實(shí)踐［M］.北京:科技出版社，2002:110-143.

［7］孫 嘯，陸祖宏，謝建明.生物信息學(xué)基礎(chǔ)［M］.北京:清華大學(xué)出版社，2006:138-162.

［8］Valcarcel CA，Dalla Serra M，Potrich C，et al.Effects of lipid composition on membrane permeabilization by sticholysinⅠandⅡ，two cytolysins of the sea anemone Stichodactyla helianthus［J］.Biophys J，2001，80(6):2761-2774.

［9］ Hong Q，Gutierrez-Aguirre I.Two-step membrane binding by equinatioxinⅡ，a pore-forming toxin from the sea anemone，involves an exposed aromatic cluster and a flexible helix［J］.J Biol Chem，2002，277(44):41916-41924.

［10］ Anderluh G，Pungercar J，Krizaj I，et al.N-terminal truncation mutagenesis of equinatoxinⅡ，a pore-forming protein from the sea anemone Actinia equina［J］.Protein Eng，1997，10(7):751-755.

Bioinformatic analysis on sea anemone hematoxins

LU Jia，XIAO Liang，WANG Qian-qian，CAI Bin-xin，ZHANG Li-ming
(Department of Chemical Defense Medicine，F(xiàn)aculty of Naval Medicine，No.2 Military Medical University，Shanghai 200433，China)

R282.76

A

1005-1678(2011)04-0332-04

2010-04-30

上海市自然科學(xué)基金(10ZR1437900)

陸 佳，女，軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)碩士研究生;張黎明，通信作者，E-mail:lmzhang1969@yahoo.com.cn。