紫外線-乙醇聯(lián)合使用對(duì)克洛諾菌屬的協(xié)同殺菌效果

傅松哲,高建新,陳海嬰,張悅,劉纓,倪賢生

（1.南昌市疾病預(yù)防控制中心，南昌 330038；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,北京 100101）

紫外線-乙醇聯(lián)合使用對(duì)克洛諾菌屬的協(xié)同殺菌效果

傅松哲1,高建新1,陳海嬰1,張悅1,劉纓2,倪賢生1

（1.南昌市疾病預(yù)防控制中心，南昌 330038；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,北京 100101）

為探討紫外線-乙醇聯(lián)合使用是否對(duì)克洛諾菌屬產(chǎn)生協(xié)同消毒效果，對(duì)0.1%稀釋復(fù)原嬰兒配方奶粉分別用乙醇，氫氧化鈉和紫外線對(duì)克洛諾菌屬NC830的殺菌效果進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)為50%和25%的乙醇處理僅引起3.65和4.05 mL-1的殺滅效果，而使用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，阪崎克洛諾菌的水平下降5.46 mL-1（對(duì)數(shù)值）。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，2.5%，5.0%的氫氧化鈉殺滅效果分別達(dá)到4.84，5.44和6.46mL-1（對(duì)數(shù)值）。 紫外線分別作用克洛諾菌屬10，20，30 min，殺滅效果分別達(dá)到1.14，2.03和2.89 mL-1（對(duì)數(shù)值）。 經(jīng)過(guò)30 min的處理，紫外線、乙醇和兩者聯(lián)合使用對(duì)阪崎克洛諾菌殺滅值分別為2.81，3.85和5.07 mL-1（對(duì)數(shù)值），紫外線-乙醇聯(lián)合使用對(duì)阪崎克洛諾菌產(chǎn)生協(xié)同消毒效果。

克洛諾菌屬；嬰兒配方乳粉；紫外線；協(xié)同效果

0 引 言

克洛諾菌屬導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)腦膜炎和敗血病等癥狀，致死率可高達(dá)50%[1]。2008年，阪崎腸桿菌正式從腸桿菌屬中劃出[2],并命名為克洛諾菌屬（Cronobacter）。一項(xiàng)由7個(gè)國(guó)家參與的國(guó)際調(diào)查顯示高達(dá)12%嬰兒奶粉中均檢出克洛諾菌屬[3]?？寺逯Z菌屬在食品加工廠及食品中均被分離出[4]。

Hein等人發(fā)現(xiàn)，克洛諾菌屬?gòu)V泛分布在乳粉生產(chǎn)區(qū)和非生產(chǎn)區(qū)[5]。重復(fù)利用的腸內(nèi)喂養(yǎng)管和回用袋增加了微生物感染的危險(xiǎn)[6]?？寺逯Z菌屬能夠在不銹鋼等多種載體上形成生物膜[7]。傳統(tǒng)的消毒措施并不能完全達(dá)到效果[8]。

乙醇和紫外線聯(lián)合使用對(duì)金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)致病菌有明顯殺菌效果[9]，然而Jo等人并沒(méi)有觀察到其具有協(xié)同殺菌的效果[10]。在本文中，我們將探索聯(lián)合使用乙醇和紫外線對(duì)材料表面克洛諾菌屬的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌種：坂崎克洛諾菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29544（Cronobacter sakazakii）； 菌株NC830（Genbank登錄號(hào)GU727683）。

（2）培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨水，LB，TSB，TSA培養(yǎng)基和微量生化管。結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）， 顯色培養(yǎng)基 （Xa-GicA、DFI）。Dey-Engley（DE）中和劑肉湯。咖啡（1+2型），全脂牛奶和低脂肪牛奶，脫脂牛奶，嬰幼兒配方奶粉。

（3）其他材料：紫外燈（型號(hào)ZW40S23W），紫外線波長(zhǎng)為253.7 nm，1m輻射照度實(shí)測(cè)為98 μw/cm2；24孔板及96孔板。

1.2 方法

1.2.1 懸液定量滅菌試驗(yàn)

克洛諾菌屬懸液定量滅菌試驗(yàn)參考Kim等人的方法[8]。將標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29544和菌株NC830采用24 h新鮮斜面培養(yǎng)物,用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗下菌苔并進(jìn)行稀釋制備成所需濃度試驗(yàn)菌懸液。將嬰幼兒配方奶粉用滅菌蒸餾水溶解，配制成0.1%的濃度，1×105Pa滅菌30 min，將菌懸液0.2%嬰幼兒配方奶以等體積混合（終濃度為0.1%）。準(zhǔn)備24孔板，加入2 mL消毒液（陽(yáng)性對(duì)照為PBS）于20℃水浴中恒溫,然后在每孔加入菌液0.5 mL立即混勻;作用至規(guī)定時(shí)間,取出2 mL加到含2 mL兩倍濃度的Dey-Engley（DE）中和劑肉湯試管內(nèi),混勻;中和作用10 min。取樣液1 mL采用0.1%蛋白胨水進(jìn)行梯度稀釋，取0.5 mL作傾注平板,36℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算滅菌率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 生物膜檢測(cè)

利用生物膜內(nèi)物質(zhì)對(duì)結(jié)晶紫的結(jié)合,通過(guò)結(jié)晶紫染色的辦法對(duì)生物膜進(jìn)行定量，參考Wakimoto等人的方法[11]。將已形成穩(wěn)定生物膜的96孔板用蒸餾水沖洗3次,洗去菌懸液,用福爾馬林固定5 min,結(jié)晶紫染色15 min,再用蒸餾水沖洗3次。放置干燥后用400 μL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇脫色30 min,所得有色溶液稀釋至1 mL用分光光度計(jì)測(cè)595 nm處吸光值。

1.2.3 紫外線殺滅效果試驗(yàn)

將上述準(zhǔn)備的24孔板中加入菌液0.5 mL，放入紫外燈正下方1 m處，加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇或滅菌蒸餾水0.5 mL，作用至規(guī)定時(shí)間,取出采用0.1%蛋白胨水進(jìn)行梯度稀釋，取0.5 mL加入平板，TSA培養(yǎng)基傾注,36℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算滅菌率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS11.5軟件進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)克洛諾菌生物膜生長(zhǎng)影響

圖1為不同培養(yǎng)基對(duì)克洛諾菌屬ATCC29544和NC830生物膜形成能力的影響。由圖1可以看出，對(duì)于不同培養(yǎng)基，坂崎克洛諾菌生物膜生長(zhǎng)量整體次序?yàn)椋旱椭Ｄ毯腿Ｄ蹋局亟M嬰幼兒配方奶粉＞脫脂牛奶＞咖啡＞LB培養(yǎng)液 ＞果汁＞0.1%蛋白胨水＞酸奶。非常值得注意的是所有克洛諾菌屬生長(zhǎng)在重組嬰兒配方奶粉和全脂牛奶中均好于傳統(tǒng)的LB和TSB培養(yǎng)液，表明各種配方奶粉都為克洛諾菌屬的生長(zhǎng)提供了更好的條件，被污染后食品安全風(fēng)險(xiǎn)極高。而pH值低的酸奶風(fēng)險(xiǎn)較低。因此，生產(chǎn)設(shè)備中殘留的微量牛奶都可以為克洛諾菌屬的生長(zhǎng)提供良好的培養(yǎng)基，并在設(shè)備表面形成不易去除的生物膜，進(jìn)而污染下一批的產(chǎn)品。

圖1中，橫坐標(biāo)FJ為果汁;OJ為橙汁;BP為緩沖蛋白胨水;Y為酸奶;SM為脫脂牛奶;WM為全脂牛奶;LFM為低脂肪牛奶；CM為咖啡混合;IF為嬰兒配方奶粉。

表1 紫外線照射對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和野生株的影響

2.2 紫外線、NaOH和乙醇對(duì)菌懸液的殺滅效果

結(jié)果表明,采用1 m輻射照度為110 μw/cm2的紫外線分別作用ATCC29544菌株10，20，30 min，照射劑量分別為555，1110和1665 mW·min/cm2。殺滅效果分別達(dá)到1.14、2.03和2.89mL-1（對(duì)數(shù)值）。對(duì)于菌株NC830紫外線的殺滅效果也非常接近。由于紫外線對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和菌株NC830幾乎沒(méi)有差別，因此為更加了解乳粉加工環(huán)境中消毒劑的殺滅效果，以下均采用野生菌株NC830進(jìn)行試驗(yàn)。體積分?jǐn)?shù)50%和25%的乙醇處理僅引起3.65和4.05mL-1（對(duì)數(shù)值）的殺滅效果，而使用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，阪崎克洛諾菌的水平下降了5.46 mL-1（對(duì)數(shù)值）。氫氧化鈉的殺滅效果好于乙醇（P＜0.05）， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%，2.5%，5.0%的氫氧化鈉殺滅效果分別達(dá)到4.84，5.44和6.46 mL-1（對(duì)數(shù)值）。經(jīng)過(guò)10 min的處理，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉效果最強(qiáng)。但與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和2.5%的氫氧化鈉相比，效果并不顯著（P＞0.05）。

2.3 NaOH和乙醇對(duì)生物膜的殺滅效果

NaOH和乙醇對(duì)克洛諾菌2 d和6 d生物膜的殺滅效果如圖4和圖5所示（結(jié)果以O(shè)D595值平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示）。分別將克洛諾菌接種至24孔板內(nèi)，培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間棄去菌懸液，分別加入終體積分?jǐn)?shù)為25%，50%和75%的乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，2.5%和5%的氫氧化鈉。采用OD595值表征消毒劑對(duì)生物膜的破壞作用。經(jīng)過(guò)30 min的處理，乙醇分別使克洛諾菌2 d和6 d生物膜OD595值下降0.38和0.64，顯著高于體積分?jǐn)?shù)25%和50%乙醇的處理效果。質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，2.5%和5%的氫氧化鈉均使克洛諾菌2 d和6 d生物膜OD595值顯著下降（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)10min的處理，3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氧化鈉均使克洛諾菌2 d和6 d生物膜OD595值下降約0.3，經(jīng)過(guò)30 min的處理，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉效果最強(qiáng)，分別使2天和6天生物膜OD595值下降0.336和0.812。但與1%和2.5%的氫氧化鈉相比，效果并不顯著。值得注意的是體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，2.5%和5%的氫氧化鈉對(duì)克洛諾菌生物膜的破壞作用并沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

2.4 乙醇和紫外線聯(lián)合使用對(duì)克洛諾菌的殺滅效果

乙醇、紫外線和兩者聯(lián)合使用的殺滅效果如圖6所示。經(jīng)過(guò)30 min的處理，3種方法對(duì)阪崎克洛諾菌殺滅值分別為2.81，3.85和5.07mL-1（對(duì)數(shù)值）。 乙醇和紫外線聯(lián)合使用作用10，20和30 min，均高于單獨(dú)使用的效果。

3 討 論

利用紫外線對(duì)農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境進(jìn)行消毒已經(jīng)有很多應(yīng)用實(shí)例[12]。在各波長(zhǎng)紫外線中，只有短波紫外線UVC具有殺菌消毒作用，具有廣譜高效、不存在抗藥性、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。然而紫外線的穿透力較差，塵粒、濕度和有機(jī)物的含量等均會(huì)對(duì)其穿透性造成影響。空氣中含塵粒多，殺菌效能就會(huì)降低；相對(duì)濕度增高，殺菌效能也會(huì)降低。同樣，紫外線在液體中的穿透力，可隨著液體深度的增加而降低，水中雜質(zhì)如溶解的鹽類、糖類與各種有機(jī)物均可降低紫外線的穿透力，阻擋紫外線的透過(guò)，從而影響其殺菌作用。乙醇作為常見(jiàn)的中效消毒劑具有成本低、適合表面消毒、對(duì)金屬材料腐蝕性低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。然而乙醇對(duì)常見(jiàn)病原菌的殺滅效果非常有限[9]，僅靠乙醇難以實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)設(shè)備表面及環(huán)境有效消毒。NaOH作為強(qiáng)效消毒劑，在乳粉加工廠中也經(jīng)常使用。然而由于其對(duì)金屬材料有很強(qiáng)腐蝕性[13]，限制了其應(yīng)用范圍。Jo等人[10]分別采用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇或2,160 mW·s/cm2的UV連續(xù)處理后，均不再檢測(cè)出阪崎克洛諾菌，同時(shí)并沒(méi)有觀察到其具有協(xié)同殺菌的效果。然而，由于其采用0.1%蛋白胨水作為菌懸液，并不能真實(shí)地反映實(shí)際消毒程序的效果。Jo等人分別采用30%,40%和50%乙醇使阪崎克洛諾菌分別下降約1.73,3.02和4.17 mL-1（對(duì)數(shù)值），去除率高于本文的試驗(yàn)結(jié)果。其原因可能就在于嬰幼兒配方奶有機(jī)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.1%蛋白胨水，減弱了其消毒效果。乙醇和紫外線聯(lián)合使用對(duì)阪崎克洛諾菌產(chǎn)生了更好的消毒效果。推測(cè)原因可能是由于乙醇使克洛諾菌細(xì)胞壁受到破壞，同時(shí)紫外線的照射促使克洛諾菌的DNA嘧啶形成一個(gè)雙鍵，從而進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

阪崎腸桿菌在乳粉加工設(shè)施中可能的污染途徑和來(lái)源是目前研究的熱點(diǎn)。對(duì)重組嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)包括配料，均質(zhì)，殺菌處理，噴霧干燥和包裝等過(guò)程。人們普遍認(rèn)為Cronobacter的污染屬于在巴氏殺菌處理后的二次污染，包括干燥和包裝等過(guò)程。Mullane等人在乳粉加工廠的所有空氣過(guò)濾器中均分離發(fā)現(xiàn)克洛諾菌屬。Craven等人的研究表明，克洛諾菌屬?gòu)V泛分布在乳粉生產(chǎn)區(qū)和非生產(chǎn)區(qū)[14]。5家工廠中2%的環(huán)境樣品中分離出克洛諾菌屬，更多的克洛諾菌屬分離在非加工區(qū)（49%），高于加工區(qū)（29%）。經(jīng)過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析，129株克洛諾菌屬劃分為49組。7株在乳粉和同一個(gè)工廠的非加工區(qū)環(huán)境均分離到，包括蒸發(fā)室，員工的鞋和外部屋頂。Hein等人[5]對(duì)奶粉加工生產(chǎn)線進(jìn)行采樣，在6個(gè)不同的采樣點(diǎn)均分離出新生兒病原體克洛諾菌屬。這些研究都表明克洛諾菌屬的污染主要來(lái)自于外部環(huán)境中，乳粉生產(chǎn)過(guò)程中防止克洛諾菌屬污染存在三個(gè)關(guān)鍵性控制點(diǎn)，即：控制頻繁的人流物流的污染，送風(fēng)空氣的處理和消毒程序的強(qiáng)化。

Fu等人[15]的研究進(jìn)一步證實(shí)了克洛諾菌屬的二次污染發(fā)生在干燥和灌裝階段這一假說(shuō)，并強(qiáng)調(diào)了對(duì)設(shè)備表面的適當(dāng)清洗的重要性。該研究模擬嬰兒配方奶粉生產(chǎn)過(guò)程等幾種亞致死實(shí)驗(yàn)。接種克洛諾菌屬在三個(gè)潛在污染的切入點(diǎn)，包括加入添加劑，噴霧干燥和灌裝。結(jié)果表明，在巴氏消毒后，沒(méi)有克洛諾菌屬的檢出。然而，在噴霧干燥過(guò)程后，發(fā)現(xiàn)了克洛諾菌屬。乳粉生產(chǎn)設(shè)備中在長(zhǎng)期運(yùn)行過(guò)程中，材料表面會(huì)產(chǎn)生微小的裂隙，存在某些死角。生產(chǎn)設(shè)備中殘存的牛奶會(huì)為克洛諾菌屬提供良好的培養(yǎng)基，使其迅速生長(zhǎng)，帶來(lái)嚴(yán)重的食品安全隱患。因此阻止克洛諾菌生物膜的形成對(duì)于杜絕該病原菌的污染十分關(guān)鍵。

Hein和Fu等人[5,15]在對(duì)加熱后的在線清洗系統(tǒng)（CIP）和模擬在線清洗后的不銹鋼材料進(jìn)行檢測(cè)，研究也表明經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的在線清洗后，克洛諾菌屬仍可檢出，表明這些在線清洗的衛(wèi)生措施無(wú)法徹底消除加工生產(chǎn)線中的克洛諾菌屬。因此，本文建議在乳粉加工廠的貯存粉倉(cāng)、噴霧干燥室和包裝室安裝紫外燈，并在消毒程序中采用，以便強(qiáng)化對(duì)材料表面和空氣的消毒處理，防止克洛諾菌屬生物膜的形成。每一批次生產(chǎn)結(jié)束后，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備材料表面采取紫外線-乙醇聯(lián)合處理，將有助于減少這些病原體的傳播。

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Synergistic effects of ethanol and UV radiation to reduce levels of Cronobacter

FU Song-zhe1，GAO Jian-xin1，CHEN Hai-ying1，ZHANG Yue1，LIU Ying2，NI Xian-sheng1
（1.Nanchang Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330038,China；2.Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China）

To investigate whether combined treatments would produce synergistic disinfection effects on food products during food processing compared with single treatments,Cronobacter sakazakii cells in suspensions and biofilms formed on polycarbonate in diluted reconstituted powdered infant milk formula were treated with ethanol,NaOH and UV light as antibacterial treatments.The bactericidal effects of a commercial chemical disinfectant（ethanol）and of UV radiation on C.sakazakii NC830 in vitro were investigated.Treatment with 25%and 50%ethanol cause a decrease in the level of 3.65 and 4.05 log CFU per ml,but treatment with 75%ethanol reduced the levels to approximately 5.46 log CFU per ml,respectively.Various exposure doses of UV radiation with a UV lamp,reduced the levels to approximately 1.14,2.03 and 2.89 log CFU per ml.The synergistic effect of ethanol or UV treatment alone values for C.sakazakii were 2.81,3.85 and 5.07 log CFU/ml,respectively.A synergistic effect of combining ethanol and UV treatments against foodborne pathogens in vitro was observed.

Cronobacter；Powder Infant Formula（PIF）；UV；synergistic effects

Q93-33

A

1001-2230（2011）09-0017-04

2011-06-20

傅松哲（1985-），男，碩士，主要從事食品微生物學(xué)研究。