水解酸化-好氧處理含油污水中微生物群落變化研究

包木太，閆廣彬，陳慶國，杜春安，郭省學，李希明

(1.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東青島 266100;2.中國石化勝利油田分公司采油工藝研究院，山東東營 257000)

水解酸化-好氧處理含油污水中微生物群落變化研究

包木太1，閆廣彬1，陳慶國1，杜春安2，郭省學2，李希明2

(1.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東青島 266100;2.中國石化勝利油田分公司采油工藝研究院，山東東營 257000)

為揭示水解酸化-好氧處理系統(tǒng)處理油田采出水過程中生物群落的變化規(guī)律，考察對不同水力停留時間(tHRT)下好氧池的生物相，提取水解酸化池和好氧池中菌體的脫氧核糖核酸(DNA)，以細菌通用引物對DNA V3高變異區(qū)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增后進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。結(jié)果表明:當水解酸化池和好氧池的水力停留時間分別大于12和16 h時，鏡檢有高級原生動物，出水CODCr去除率大于58.73%，含油去除率大于98.61%;水解酸化-好氧處理工藝在不同tHRT條件下運行后，在形成的細菌群落中，既有相同的優(yōu)勢群落，也有各自特有的優(yōu)勢群落;隨著tHRT的延長，水解酸化池中優(yōu)勢群落的種類和數(shù)量增加，當tHRT＞12 h時，優(yōu)勢群落變化較小，形成穩(wěn)定的細菌群落，出水水質(zhì)趨于穩(wěn)定;隨著tHRT的延長，好氧處理池中優(yōu)勢群落的種類和數(shù)量減少，當tHRT＞16 h時，優(yōu)勢群落變化較小，形成穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，出水水質(zhì)趨于最佳。

微生物群落;水解酸化;好氧處理;含油污水;變性梯度凝膠電泳

我國油田普遍采用“隔油—混凝—過濾”［1］“三”處理工藝，對去除廢水中的石油類、懸浮物等雜質(zhì)效果理想，但對于中溶解性的石油類和CODCr去除效果不明顯。活性污泥是由細菌、微生物與懸浮物質(zhì)、膠體物質(zhì)混雜在一起所組成的絮狀體顆粒［2-3］，與傳統(tǒng)的活性污泥法相比，水解酸化-好氧處理工藝具有投資小、能耗低和運轉(zhuǎn)費用低等優(yōu)點，可以用于含油和化學需氧量(CODCr)的去除。隨著以16S rDNA為主要基石的細菌分子分類學的發(fā)展，出現(xiàn)了變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)［4-6］。用DGGE研究微生物群落中的細菌多樣性在污水處理中得到應用［7］。筆者針對水解酸化-好氧處理系統(tǒng)，利用DGGE技術(shù)對不同水力停留時間(tHRT)的活性污泥進行研究，通過分析生物群落，考察污泥中生物群落的變化與出水水質(zhì)的關(guān)系。

1 實驗

實驗儀器包括:MyCycler PCR擴增儀(BIORAD，USA);SX-300成像系統(tǒng)(Shanghai Sixing Biological Technology Co Ltd);DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠);Mini-Transilluminator紫外透射儀(BIORAD，USA);GS-15R Centrifuge離心機(Beckman，USA);Reagent TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.1 實驗方法

1.1.1 樣品脫氧核糖核酸提取

保持水解酸化-好氧處理系統(tǒng)運行參數(shù)穩(wěn)定，通過調(diào)節(jié)進水水量，改變水力停留時間，對反應池中的生物相進行鏡檢，并測定出水的CODCr質(zhì)量濃度(ρCOD)和所含油的質(zhì)量濃度。ρCOD采用密封微波消解法測定［8］，含油質(zhì)量濃度采用紫外分光光度法測定［9］。

當系統(tǒng)出水水質(zhì)穩(wěn)定后，用2 mL無菌離心管取反應池中的混合液，12 000 r/min離心分離10 min，棄去上清液，樣品保存于-20℃冰箱中［10］。

采用TakaRa的ReagentTaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0試劑盒，提取污泥中的脫氧核糖核酸(DNA)。試劑盒中包括:Lysozyme、Glycerol、EDTA Buffer、SP Buffe、Solution A、Solution B、Solution C、DB Buffer、Rinse A 、Rinse B、Elution Buffer、Filter Cup、Spin Column、Collection Tube(2 mL)。提取方法參照說明書。

配置1%的瓊脂糖凝膠，每個樣品取5 μL，然后加入約1 μL 6×Loading buffer的點樣液，向凝膠點樣孔中點樣，并用λm作marker。電泳大約30 min，將瓊脂糖凝膠放于含有溴化已錠(EB)的溶液中染色10 min，最后用UVI凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。提取的DNA樣品保存在-20℃的冰箱中。

1.1.2 DNA V3區(qū)的PCR擴增

將純化的基因組DNA試樣作為聚合酶鏈反應的模板，用基因擴增儀(PCR)對模板DNA的16S rDNA的V3可變區(qū)進行擴增，基因擴增所用引物為SP2(5＇-ATTACCGCGGCTGCTGG-3＇)，SP3(5＇-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg CCTACGGGAGGCAGCAG-3＇)［11］，PCR 擴增體系及程序采用Muyzer等［5］的方法。

PCR體系的基本參數(shù)為:正向引物 SP2 0.4 μL;反向引物 SP3 0.4 μL;10×Buffer 2.5 μL;dNTP(含 MgCl2)2 μL;Taq 酶 0.2 μL;模板 DNA 1 μL;ddH2O 18.5 μL?？傮w積 25 μL。

PCR擴增采用的程序為:94℃ 1 min;(94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 1.5 min)20個循環(huán);(94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min)10個循環(huán)，72℃ 6 min，4 ℃保溫。

使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，用UVI凝膠成像系統(tǒng)記錄實驗結(jié)果。

1.1.3 DGGE分析

16S rDNA V3區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物可以通過DGGE進行分離。使用Bio-Rad公司DCode系統(tǒng)進行DGGE分析，變性劑梯度為30% ～60%(100%變性劑的濃度為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺)。實驗采用8%聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為1×Tris-Acetate-EDTA(TAE，pH=8.4)［12］。在電壓200 V，溫度60℃的條件下電泳240 min，電泳結(jié)束后Gene finder染色30 min，然后用UVI凝膠成像系統(tǒng)保存實驗結(jié)果。

采用美國Bio-Rad公司的Quantity One軟件對DGGE圖譜進行優(yōu)化分析［13］，根據(jù)戴斯相關(guān)系數(shù)計算兩組條帶之間的相似性，利用算術(shù)平均數(shù)非加權(quán)配對組算法進行聚類分析［14］。

1.2 實驗流程

實驗用水為陳莊注水站采出水，采用水解酸化-好氧處理工藝進行處理，如圖1所示。來水由反應器底部進入水解酸化池，顆粒物質(zhì)和膠體物質(zhì)迅速被截留和吸附，截留下來的物質(zhì)吸附在水解反應池污泥的表面，慢慢地被分解代謝，在大量水解細菌的作用下將不溶性有機物水解為溶解性物質(zhì)，同時在產(chǎn)酸菌的協(xié)同作用下將大分子物質(zhì)、難以生物降解的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為易于生物降解的小分子物質(zhì)，重新釋放到液體中，提高了廢水的可生化性，利于后續(xù)好氧活性污泥生物降解［15］。

圖1 實驗工藝流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of technological process

水解酸化池和好氧處理池的有效容積均為10 L。水解酸化池為上流式污泥床(UASB)反應器，通過控制反應停留時間和曝氣、攪拌等措施將反應控制在水解酸化階段。來水經(jīng)過水解酸化池處理后進入好氧處理池，最后進入沉降池泥水分離后出水。沉降池中一部分活性污泥回流進入水解酸化池。實驗過程中，污泥參數(shù)保持穩(wěn)定，溫度控制在24～26℃，好氧處理池的溶解氧為3～5 mg/L。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同tHRT的出水水質(zhì)

污水中污染物主要由微生物去除，水解酸化池和好氧處理池的tHRT即為微生物生長代謝的時間。從進水后的8 h起，每隔4 h取一次樣，測定了不同停留時間條件下的ρCOD和含油量，結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 不同tHRT下CODCr的去除效果Fig.2 Removal of CODCrat different hydraulic retention time

圖3 不同tHRT下含油的去除效果Fig.3 Removal of oil at different hydraulic retention time

由圖2、3可以看出:經(jīng)過水解酸化，對廢水中CODCr有部分去除，對原油的降解較為明顯;隨著tHRT的延長，兩個反應池的CODCr和原油的去除有所提高;對于水解酸化池，當tHRT大于12 h后，CODCr和原油的去除變化幅度較小;對于好氧處理池，當tHRT大于16 h時，ρCOD和含油量達到最低值。

2.2 生物相的觀察

水解酸化池中沒有原生動物，細菌含量大約在107個/mL，且隨著tHRT的改變，細菌的種類和數(shù)量有所變化。對好氧處理池中不同tHRT的活性污泥進行鏡檢，當tHRT為8 h時，出水的ρCOD和含油量較高，且好氧處理池的污泥略微發(fā)黑，細菌數(shù)量較多，大量的草履蟲、滴蟲的出現(xiàn)表明污泥負荷較高。當tHRT為12 h時，經(jīng)處理后的水質(zhì)有所改善，好氧處理池中出現(xiàn)了變形蟲，說明水質(zhì)正在發(fā)生變化。當tHRT為16 h時，出水水質(zhì)得到很大改善，生物群落發(fā)生了明顯的變化，出現(xiàn)了輪蟲、游仆蟲等高級原生動物，細菌數(shù)量明顯減少。當tHRT為20 h時，ρCOD和含油量變化較小，鐘蟲的出現(xiàn)說明好氧處理池中的污泥形成了穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，此時出水水質(zhì)較好。當tHRT為24 h時，出水水質(zhì)的變化不大，蓋蟲的出現(xiàn)表明污泥的負荷較低。

2.3 DNA V3片段擴增后的瓊脂糖凝膠電泳

微生物可以利用污水中的污染物進行代謝活動，而污染物的種類和含量限制微生物的生長和繁殖。對不同tHRT污泥樣品進行16S rDNA V3區(qū)擴增，結(jié)果見圖4。瓊脂糖凝膠電泳所得條帶即為目的擴增片段。條帶編號1、2、3、4、5對應的 tHRT分別為 8、12、16、20、24 h。得到的 DNA 基因片段約為230 bp。擴增產(chǎn)物可以用于DGGE分析。

圖4 不同tHRT的PCR結(jié)果Fig.4 PCR result at different hydraulic retention time

2.4 不同tHRT的DGGE分析

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，物種是構(gòu)成微生物群落進而組成生態(tài)系統(tǒng)的基本單元［16］。因此，生態(tài)系統(tǒng)的多樣性離不開物種的多樣性和物種具有的遺傳多樣性。分析了不同tHRT條件下水解酸化和好氧處理系統(tǒng)中細菌的16S rDNA V3區(qū)擴增，結(jié)果見表1。

表1 不同tHRT的DGGE條帶Table 1 Result of DGGE at different hydraulic retention time

圖5 不同tHRT的DGGE結(jié)果Fig.5 DGGE result at different hydraulic retention time

污泥樣品PCR-DGGE結(jié)果見圖5。每個樣品分離出不同的若干電泳條帶，且各條帶所代表的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和遷移率不同，因而表征了污泥樣品中的優(yōu)勢菌落的分布。根據(jù)DGGE對DNA不同片段的分離原理，這些分離出來的條帶都是不同細菌16S rRNA基因V3區(qū)片段。每個條帶原理上可以代表一個微生物種屬。條帶信號越強表示該微生物種屬在污泥樣品中的優(yōu)勢地位越明顯。根據(jù)DGGE圖譜可以初步判斷微生物種屬的種類和數(shù)量與tHRT和出水水質(zhì)的關(guān)系。

由圖5(a)可看出:隨著tHRT的延長，細菌的種類和數(shù)量不斷增加，當tHRT＞12 h時，細菌群落趨于穩(wěn)定;隨著細菌的種類和數(shù)量增加，出水中COD和原油的去除增加幅度較大，當tHRT＞12 h時，細菌群落生長受到營養(yǎng)的限制，細菌群落趨于穩(wěn)定，出水中COD和原油的去除效果變化較小，趨于穩(wěn)定。對于水解酸化池優(yōu)勢細菌種類和數(shù)量的變化與污水的處理效果趨勢吻合。

由圖5(b)看出:隨著tHRT的延長，細菌的種類和數(shù)量逐漸減少，當tHRT＞16 h時，細菌群落趨于穩(wěn)定。當tHRT=8 h時，進水中易被細菌利用的營養(yǎng)物質(zhì)較豐富，污泥中細菌迅速繁殖，對進水COD和原油的去除效果較明顯;當tHRT＞12 h時，隨著進水中可被利用的營養(yǎng)物質(zhì)的減少，污泥中細菌種類和數(shù)量也不斷減少，形成新的優(yōu)勢細菌群落，出水COD和原油的去除率不斷增加，增幅不斷減小。當tHRT＞16 h時，形成的優(yōu)勢細菌群落的種類和數(shù)量趨于穩(wěn)定，出水的COD和原油的去除效果也趨于穩(wěn)定。

通過DGGE圖譜可以發(fā)現(xiàn)，不同tHRT條件下，水解酸化池和好氧處理池的優(yōu)勢菌種既有相同又有不同:對于水解酸化池，隨著tHRT的延長，細菌群落的種類和數(shù)量增加;對于好氧處理池，隨著tHRT的增加，細菌群落的種類和數(shù)量有減少的趨勢。在整個過程中既存在始終保持穩(wěn)定的優(yōu)勢菌種或始終穩(wěn)定存在但并不占優(yōu)勢的菌種，也有隨著培養(yǎng)馴化逐漸被淘汰的菌種，還有在新的環(huán)境馴化下逐漸演替為優(yōu)勢地位的菌種［17］。

通過聚類分析，對不同tHRT條件下的水解酸化池和好氧處理池的細菌群落進行相似性分析［18］，結(jié)果見圖6。對于水解酸化池，A-2與A-1、A-3的相似性變化較大，說明細菌群落發(fā)生較大變化;隨著tHRT的延長，相鄰tHRT的菌落的相似性不斷增加，A-4和A-5的相似性高達91%，表明污泥中細菌群落比較穩(wěn)定。對于好氧處理池，O-2與O-1、O-3的相似度變化較大，表明隨著tHRT的延長細菌群落變化較大;O-3、O-4、O-5之間的相似度較高，表明當 tHRT＞16 h時，隨著tHRT的延長細菌群落變化較小。

圖6 不同tHRT條件下細菌群落相似性的分析Fig.6 Bacterial community similarity analysis at different hydraulic retention time

3 結(jié)論

(1)當水解酸化池和好氧處理池的tHRT分別大于12和 16 h時，鏡檢有高級的原生動物，出水CODCr的去除率大于58.73%，原油的去除率大于98.61%。

(2)水解酸化-好氧處理工藝在不同tHRT條件下運行后，在形成的細菌群落中，既有相同的優(yōu)勢群落，也有各自特有的優(yōu)勢群落:水解酸化池中，隨著tHRT的延長，優(yōu)勢群落的種類和數(shù)量增加，當tHRT＞12 h時，優(yōu)勢群落變化較小，形成穩(wěn)定的細菌群落，出水水質(zhì)趨于穩(wěn)定;好氧處理池中，隨著tHRT的延長，優(yōu)勢群落的種類和總量減少，當tHRT＞16 h時，優(yōu)勢群落變化較小，形成穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，出水水質(zhì)趨于最佳。

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Study on change of microbial community structure in hydrolytic acidification-aerobic biological treatment oily wastewater

BAO Mu-tai1，YAN Guang-bin1，CHEN Qing-guo1，DU Chun-an2，GUO Sheng-xue2，LI Xi-ming2
(1.Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266100，China;2.Research Institute of Oil Production Technology，Shengli Oilfield，SINOPEC，Dongying 257000，China)

In order to reveal the biological community changes of hydrolytic acidification-aerobic system in oilfield produced water treatment，the biological phase of aerobic tank was observed，and the genomic DNA of microbial communities was extracted.The V3 region in DNA was amplified by the universal primers，and the bacterial community structure of hydrolytic acidification-aerobic system was studied by polymerase chain reaction(PCR)amplification and denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE).The results show that the removals of CODCrand oil content in oil wastewater are more than 58.73%and 98.61%when the hydraulic retention times(HRT)of anoxic tank and aerobic tank are beyond 12 h and 16 h respectively.The senior protozoa could be found in treated wastewater by the microscopic.From the profiles of DGGE bands，it can be seen that both the similarities and differences existed in the main bacterial community of treated wastewater after hydrolytic-aerobic biological treatment under different HRT condition.In the hydrolysis tank，with the increase of HRT，the species and quantity of the main bacterial communities increase.When the HRT is longer than 12 h，the main microbial community seldom changes，and the stable community and water quality are formed.While in the aerobic treatment tank，the species and quantity of the main bacterial communities decrease with the increase of HRT.When the HRT is longer than 16 h，the main microbial community seldom changes，and the stable community is also formed，the best water quality is obtained.

microbial community;hydrolytic acidification;aerobic biological treatment;oily wastewater;denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)

X 703.1

A >

10.3969/j.issn.1673-5005.2011.04.032

1673-5005(2011)04-0167-05

2011-03-20

青島市應用基礎(chǔ)研究計劃項目(09-1-3-17-jch);“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAB04B02)

包木太(1971-)，男(漢族)，山東臨沂人，教授，博士，博士生導師，主要從事微生物驅(qū)油理論、環(huán)境生物修復應用基礎(chǔ)、油品指紋信息提取與鑒別及生物氧化除油技術(shù)研究。

(編輯 劉為清)