呼吸道患病犬菌群組成及病因分析

解秀梅 蔣含偉 張麗芳 牛玉豐

（青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海湟源 812100）

寵物犬呼吸道疾病是臨床常見病、多發(fā)病，在寵物犬疾病中占很大比例，常因發(fā)病原因復(fù)雜[1]，很難做出確切的臨床診斷，給疾病治療帶來很大的困擾。若治療不及時(shí)或者不合理，加重病情而危及生命。因此，了解西寧地區(qū)寵物犬呼吸道疾病的發(fā)生原因和患呼吸道疾病的菌群組成，可以為西寧地區(qū)寵物醫(yī)院治療呼吸道疾病提供有利可行的科學(xué)依據(jù)，也可以提高寵主的防護(hù)意識(shí)，減少寵物犬呼吸道疾病的發(fā)生。

1 材料

1.1 研究對(duì)象

選取青海省西寧地區(qū)佰匯緣寵物醫(yī)院、好伙伴寵物醫(yī)院等相關(guān)醫(yī)院7家，在2018年2月至2018年6月內(nèi)選取患有呼吸道疾病，并伴有明顯呼吸道癥狀，如咳嗽、流鼻涕或出現(xiàn)黃膿鼻涕的犬只，共92例作為研究對(duì)象。其中1歲以下病例67例，占總患病樣本的72.8%；1～8歲的病例25例，占總患病樣本的27.2%。

1.2 快速診斷試劑板

犬瘟熱（CDV）、犬副流感（CIV）、犬腺病毒感染（CAV）等相應(yīng)的病毒病的抗原快速診斷試劑板均為韓國安捷動(dòng)物診斷試劑有限公司生產(chǎn)。革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡和革蘭陽性細(xì)菌鑒定卡購自于梅里埃生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

増菌液選用LB液體培養(yǎng)基，制備方法：胰蛋白胨10g，氯化鈉5g，酵母粉10g，1000ml溶液，溶解后，調(diào)節(jié)PH值并高壓滅菌。進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基。配方：LB液體培養(yǎng)基1000ml，瓊脂粉20g。進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)時(shí)選用的是TSA培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 樣本采集

采用咽拭子采集法，事先在專用咽拭子采集管中放入2ml無菌LB液體培養(yǎng)基。樣本采集時(shí)使用一次性無菌棉拭子進(jìn)行咽部深層旋轉(zhuǎn)采集，采集的拭子迅速插入采集管中旋轉(zhuǎn)以利于細(xì)菌的洗脫，之后立即蓋緊蓋口。注意采集時(shí)棉拭子盡量避免接觸口腔和舌黏膜。收集的咽拭子標(biāo)本立即放入-20℃的冰箱儲(chǔ)存。

2.2 病毒篩查

對(duì)未進(jìn)行疫苗注射的犬只，按犬瘟熱（CDV）、犬副流感（CIV）、犬腺病毒感染（CAV）快速診斷試劑板的操作步驟進(jìn)行呼吸道常見病毒病的篩查診斷。

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取出儲(chǔ)存于冰箱的咽拭子培養(yǎng)基，放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌復(fù)蘇培養(yǎng) 4～8h，之后取增菌培養(yǎng)液接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～48h。挑出分離培養(yǎng)結(jié)果為陽性的固體LB培養(yǎng)基，根據(jù)形成的菌落形態(tài)、大小等不同的特征，分別進(jìn)行純培養(yǎng)；并進(jìn)行革蘭氏染色鏡鑒。

2.4 菌種的鑒定

最后將純培養(yǎng)出的細(xì)菌接種于TSA培養(yǎng)基，后按MicroScan WalkAway-40（西門子公司）全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的操作要求和步驟，根據(jù)染色結(jié)果選擇相對(duì)應(yīng)的革蘭陰性細(xì)菌或革蘭陽性細(xì)菌鑒定卡，進(jìn)行細(xì)菌種屬鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒篩查結(jié)果

樣本經(jīng)病毒快速診斷試劑板檢測(cè)，結(jié)果由病毒感染引起的呼吸道疾病有19例，具體情況如下表1。

表1 犬呼吸道病毒感染統(tǒng)計(jì)表

3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

92份病例樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)后，有13份未生長出菌落，其余79份都有不同程度的菌落形成，占總體病例的85.9%。對(duì)每份中形成的不同菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，共計(jì)104株菌。有23個(gè)病例樣本分離到兩種或兩種以上菌株。

3.3 分離鑒定結(jié)果

將純培養(yǎng)的104株菌經(jīng)過染色鏡檢后，確定革蘭陰性菌34株，革蘭陽性菌70株，經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的鑒定，最終確定細(xì)菌種屬12種。其中葡萄球菌種類和數(shù)量較多，合計(jì)分離率為48.1%，其次是放射根瘤菌。主要呼吸道致病菌金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌臭鼻亞種，分離率合計(jì)為15.3%。其具體分離情況和菌種生化結(jié)果見表。

4 討論與結(jié)論

從患呼吸道疾病的寵物犬來看，年齡幼小的犬較易發(fā)呼吸道疾病，其中1歲以內(nèi)的幼犬發(fā)病概率和數(shù)量均較高，年齡較大的犬發(fā)生率較低，這可能與幼犬自身免疫力低下及氣管粘膜脆性有關(guān)[2]。其次，在西寧地區(qū)，幼犬的呼吸道疾病中病毒引起的感染不可忽視，其感染率達(dá)28.4%，其中犬瘟熱病毒感染比例最大，占幼犬病例的19.4%。而成年犬病毒感染發(fā)生極少。這可能與幼犬未能及時(shí)注射疫苗，且易受環(huán)境因素的影響而使呼吸道抵抗力下降有關(guān)[3]，而成年犬疫苗注射完全且抵抗力較強(qiáng)[5]。因此及時(shí)的疫苗免疫是防制幼犬呼吸道病毒感染的關(guān)鍵措施。

表2 分離鑒定菌株名稱及所占比例表

在呼吸道感染的總體病例中可以看到，病毒和主要致病菌感染占36.1%，其他原因如支原體、真菌、過敏等原因引起的更是少見[1、6、8]，而且犬呼吸道疾病易發(fā)生于氣候變化較大的早春晚秋[7]，這就意味著，犬呼吸道疾病大部分是由于環(huán)境發(fā)生改變，引起呼吸道菌群失調(diào)或條件性致病菌的大量繁殖而發(fā)病。因次，環(huán)境因素的刺激或改變是導(dǎo)致犬呼吸道疾病發(fā)生的主要原因。建議寵主在環(huán)境發(fā)生改變時(shí)采取相應(yīng)的清潔、保暖等防護(hù)措施減少寵物犬呼吸道疾病的發(fā)生。

從患病犬呼吸道菌群分離的相對(duì)情況而言，除未分離出菌種的13份（占總病例的14.1%）病例樣本外，其余病例83.9%的病例都可分離出細(xì)菌，主要分離菌為葡萄球菌。肖焰[8]等調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)犬瘟熱發(fā)病期細(xì)菌引起的呼吸道感染率達(dá)90%，這也說明犬呼吸道疾病中前期或后期都有細(xì)菌感染的參與。因此臨床用藥治療呼吸道疾病或繼發(fā)感染可偏抗革蘭氏陽性菌，尤其是葡萄球菌的抗生素。

在92例呼吸道感染病例中，有19例混合感染病毒性疾病，有23例病例分離出兩種及兩種以上的菌株，可見呼吸道疾病中通常是以混合感染的形式出現(xiàn)[9]，混合感染率達(dá)45.6%。因此臨床用藥不能忽視混合感染，若只使用單一抗生素可能達(dá)不到較好的治療效果[10]。呼吸道感染的細(xì)菌種類繁多，在呼吸道感染病例治療時(shí)，最好進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用合理的藥物，避免盲目用藥和濫用抗生素而導(dǎo)致耐藥性的急劇升高[11]。同時(shí)，還要結(jié)合其他綜合性的治療方法，如加強(qiáng)營養(yǎng)、加強(qiáng)護(hù)理等也是關(guān)鍵[12]。