雷諾定受體2在抑郁大鼠心房顫動(dòng)中的作用*

儲(chǔ)睿 殷瑛 周興宇 石少波 朱剛艷

雷諾定受體2(RyR2)是位于心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)上重要的鈣離子釋放通道。Voigt等[1]研究發(fā)現(xiàn)心房顫動(dòng)(簡稱房顫)發(fā)生時(shí)，RyR2功能改變，可介導(dǎo)肌漿網(wǎng)自發(fā)性鈣釋放增加，并引起持續(xù)性房顫。近年來臨床數(shù)據(jù)證實(shí)焦慮、憤怒、壓力、抑郁等應(yīng)激相關(guān)情緒是房顫的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。焦慮、抑郁等直接影響心房電活動(dòng)，觸發(fā)房顫，其具體機(jī)制尚不清楚。筆者探討RyR2在抑郁大鼠房顫發(fā)生中的作用，并運(yùn)用RyR2拮抗劑丹曲林進(jìn)行干預(yù)，旨在尋找房顫治療新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性SD大鼠70只，體重180～220 g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法將大鼠分為4組：正常對照組(CTL組,n=15),正常丹曲林組(DAN組,n=15)，抑郁組(CUMS組,n=20),抑郁加丹曲林(C+D組,n=20)。CTL組和CUMS組每日腹腔注射2 ml/kg生理鹽水，其余兩組同時(shí)每日腹腔注射1%丹曲林(Sigam公司)藥液2 ml/kg，連續(xù)4周。CUMS組和C+D組在給藥的同時(shí)，給予不可預(yù)見的慢性溫和刺激造成抑郁。

1.2抑郁模型制作 給予慢性不可預(yù)見性溫和刺激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)建立抑郁模型：禁食24 h，禁水24 h，夾尾1 min(夾在大鼠尾根部約1 cm處)，鼠籠傾斜45° 24 h，潮濕墊料24 h，限制行為24 h，4℃冰水游泳5 min，42℃熱水游泳5 min，持續(xù)光照24 h，捕食者聲音30 min，搖晃鼠籠15 min。 將上述11種刺激隨機(jī)安排到4周中，每天一種刺激。同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使得動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，避免發(fā)生適應(yīng)[3-4]。于實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中第7、14、21、28天測量大鼠體重。

1.3行為學(xué)評(píng)價(jià) 從第5周開始進(jìn)行糖水消耗試驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST)進(jìn)行評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否抑郁。糖水消耗實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[5]，在實(shí)驗(yàn)前三天訓(xùn)練大鼠適應(yīng)飲用糖水。每個(gè)鼠籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第1天，兩瓶均裝1%的糖水：第二天，一瓶裝1%的糖水，一瓶裝純水：隨后禁水24 h，再進(jìn)行大鼠的基礎(chǔ)糖水/純水消耗量。同時(shí)給予每只大鼠事先定量的1%糖水和純水。2 h后，取兩瓶水稱量。計(jì)算動(dòng)物的糖水偏愛百分比[糖水偏愛=糖水消耗/(糖水消耗+純水消耗)×100%]。

FST參照文獻(xiàn)[6],將大鼠放入直徑為23 cm、高60 cm的測試桶中，桶中的水溫為25℃±1℃。進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)前預(yù)先強(qiáng)迫大鼠游泳15 min，然后取出，用毛巾擦干身體上的水放回鼠籠。禁食但不禁水12 h后，再次強(qiáng)迫游泳6 min，前2 min讓大鼠適應(yīng)環(huán)境，記錄后4 min中不動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間。每只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前更換桶中的水。

1.4離體灌流 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在飼養(yǎng)4周結(jié)束，進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)后，開始進(jìn)行離體灌流實(shí)驗(yàn)。具體方法如下：首先經(jīng)腹腔注射肝素鈉(華北制藥有限公司)400 U對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行抗凝，10 min后腹腔注射2%苯巴比妥鈉40 mg/kg，待大鼠深度麻醉后以頸椎脫臼處死。從胸骨左緣約1 cm處開胸，充分暴露心臟及主動(dòng)脈根部，迅速取出心臟,置于100%氧飽和的4℃生理鹽水中洗凈殘血，剪去心包膜及周圍結(jié)締組織，繼而將灌流管插入主動(dòng)脈根部連接灌流設(shè)備，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注提前配置的臺(tái)式液。灌流液保持37℃±0.5℃，并給予95%O2、5%CO2進(jìn)行通氣，灌流速度維持7～9 ml/min,灌注壓維持80 mmH2O。對心臟進(jìn)行修剪處理，剪去無法恢復(fù)自主節(jié)律的心臟組織。

1.5離體電生理研究 離體心臟組織在Langendorff裝置中靜待15 min，觀察心臟的自主節(jié)律，待心臟自主節(jié)律穩(wěn)定后，將刺激電極放置于右房，AgCl電極放置于左房位置記錄心房的單相動(dòng)作電位(monophasic action potential，MAP)，MAP采用PowerLab放大器記錄，并采用LabChart7.0軟件分析。①有效不應(yīng)期(effective refractory period，ERP)測定：連續(xù)發(fā)放8個(gè)起搏刺激波S1后發(fā)放早搏刺激波S2(S1S2=250 ms)。每次遞減10 ms的降低S1S2間期，如果S2能誘發(fā)出動(dòng)作電位，則繼續(xù)以10 ms減少S1S2間期,當(dāng)S2不能誘發(fā)出動(dòng)作電位時(shí)，則將S1S2增加10 ms，然后以2 ms遞減直至S2不能誘發(fā)出動(dòng)作電位，此時(shí)S1S2間期即為左房的ERP。②連續(xù)發(fā)放8個(gè)起搏刺激S1(S1S1)分別給予250，200，150和100 ms周長(cycle length，CL)程控刺激，測心房的動(dòng)作電位恢復(fù)90%的時(shí)程(APD90)。③運(yùn)用Burst刺激誘發(fā)房顫，刺激電極和記錄電極分別放置于右房和左房，刺激電極給予50 Hz持續(xù)時(shí)間2 s，間隔時(shí)間2 s的Trian刺激，總的刺激時(shí)間小于2 min，房性心律失常持續(xù)時(shí)間超過2 s即為可誘發(fā)。

1.6RyR2和磷酸化(P)-RyR2(2808)受體蛋白表達(dá)檢測 取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心房組織，迅速將標(biāo)本放置于液氮中冷藏，防止蛋白變性，并置于-80℃冰箱冷凍保存至檢測。按照蛋白抽提試劑盒說明書分離提取蛋白,配置相應(yīng)濃度的PAGE膠，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗過夜：RyR2 、P-RyR2(2808)。TBST洗滌后加入相應(yīng)的氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育，用ECL顯影定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為上樣內(nèi)參，計(jì)算上述蛋白的相對表達(dá)量?？贵w皆購買于Abcam公司，PVDF購于Millipore公司，HRP和GAPDH內(nèi)參購買于杭州賢至生物有限公司。

1.7數(shù)據(jù)處理 用SPSS 21.0軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用兩個(gè)樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組之間的比較用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

4周后，60只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活，CTL組、DAN組、CUMS組和C+D組最后分別入選13、14、15、18只大鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率為14.3%。CTL組和DAN組大鼠在進(jìn)行FST過程中死亡；CUMS組和C+D組大鼠在進(jìn)行抑郁刺激過程中死亡。

2.14組動(dòng)物體重和行為學(xué)結(jié)果比較 實(shí)驗(yàn)前，各組大鼠之間體重?zé)o差異，4周后，CUMS組體重增加較其他組少。4周后，CUMS組總的液體消耗量無明顯變化而糖水消耗量明顯減少，說明動(dòng)物快感減少；C+D組糖水偏好百分比有所升高。CUMS組FST中靜止時(shí)間明顯長與其他組，C+D組實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所改善。CTL組與DAN組各指標(biāo)間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2離體電生理結(jié)果 CTL組與DAN組之間ERP和APD90無差異(P>0.05)。與CTL組和DAN組比較，CUMS組中的ERP和APD90都減少(P<0.01)，ERP/ APD90顯著減少；C+D組ERP和APD90變化幅度較小(P<0.05)。與CTL和DAN組比較，C+D組上述指標(biāo)降低；與CUMS組比較，C+D組，上述指標(biāo)有所升高。見表2。

表1 4組動(dòng)物體重和行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果比較

注：前=指開始進(jìn)行4周刺激前；后=指4周刺激結(jié)束后；與CTL組比較,*P<0.05；與C+D組比較,#P<0.05

表2 4組動(dòng)物相關(guān)電生理指標(biāo)結(jié)果比較

注：ERP=有效不應(yīng)期；APD90=90%動(dòng)作電位時(shí)程；與CTL組比較：*P<0.05；與C+D組比較：#P<0.05；與CTL組和DAN組比較，&P<0.05

CUMS組大鼠房顫誘發(fā)率明顯高于其他組(P<0.05)；CTL組與DAN組無明顯差異(0 vs 0，P>0.05)；C+D組雖然可以誘發(fā)房顫，但房顫誘發(fā)率低于CUMS組(4/10 vs 10/10,P<0.05)，而且停止Burst后，房顫自行停止時(shí)間較CUMS組短。見圖1。

圖1 4組Burst刺激下心電圖

2.3蛋白表達(dá)水平檢測 各組總RyR2受體表達(dá)量無顯著差異(0.64±0.12 vs 0.62±0.08 vs 0.58±0.09 vs 0.59±0.10，P均>0.05)；與CTL組比較，CUMS組P-RyR2(2808)表達(dá)量明顯增加(0.64±0.11 vs 0.19±0.08，P<0.01)，C+D組的P-RyR2(2808)較CUMS組有所減少(0.48±0.10 vs 0.64±0.11，P<0.01)，CTL組和DAN組兩者之間無明顯差異(0.19±0.08 vs 0.21±0.06，P>0.05)。見圖2。

圖2 4組動(dòng)物RyR2受體、P-RyR2(2808)表達(dá)量

3 討論

國內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠體內(nèi)多項(xiàng)電生理指標(biāo)異常，房顫誘發(fā)率增加，臨床上也有相似的發(fā)現(xiàn)[7-8]。有研究表明，房顫發(fā)生時(shí)，RyR2功能改變，其介導(dǎo)的自發(fā)性鈣釋放增加，并引起持續(xù)性房顫[9-10]。RyR2是心肌細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)上重要的鈣離子釋放通道，可影響心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度[11-12]。位于肌漿網(wǎng)上的RyR2功能異?？赡苁且钟舸笫笠子谡T發(fā)房顫的重要原因。

本文旨在探究RyR2在抑郁大鼠房顫中的作用，并運(yùn)用RyR2拮抗劑丹曲林進(jìn)行干預(yù)，為房顫特別是應(yīng)激誘導(dǎo)房顫的治療提供新的指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用目前國內(nèi)外普遍接受的慢性應(yīng)激抑郁模型，后期結(jié)果顯示，抑郁大鼠活動(dòng)度下降，體重增加減慢，糖水消耗量減少，F(xiàn)ST靜止時(shí)間增加；ERP反應(yīng)心肌細(xì)胞膜去極化能力，而APD主要反映復(fù)極化速度；一般情況下，ERP/ APD90比值減小有利于心律失常的發(fā)生[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)抑郁導(dǎo)致大鼠ERP/ APD90比值減小，并且房顫誘發(fā)率明顯增加。抑郁模型中RyR2的S2808明顯被磷酸化，丹曲林可以改善這種異常磷酸化；CTL與DAN組中上述蛋白無明顯變化。文獻(xiàn)表明丹曲林對正常離體心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)的RyR2無作用[14-15]。正常情況下，首先興奮沖動(dòng)傳導(dǎo)到心肌細(xì)胞膜，激活細(xì)胞膜上鈣誘導(dǎo)鈣釋放(Ca2+induced Ca2+release，CICR)，繼而為心肌收縮肌質(zhì)網(wǎng)提供鈣離子,引發(fā)心肌細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)(Ca2+induced Ca2+release，ECC)過程[16]。RyR2位于心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)上鈣離子釋放通道，主要影響胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度。蛋白激酶A(protein kinase A; PKA)和鈣調(diào)蛋白(calmodulimⅡ, CaMⅡ)分別可以過磷酸化RyR2上的ser2808，導(dǎo)致其功能異常出現(xiàn)舒張期鈣漏[17-19]。

所以有理由推測RyR2功能異常是抑郁患者易于發(fā)生房顫的重要機(jī)制之一。本研究中抑郁組ser2808位點(diǎn)被過磷酸化，而用丹曲林治療后過磷酸化情況好轉(zhuǎn)。抑郁等應(yīng)激刺激導(dǎo)致大鼠心臟RyR2受體功能異常，加用丹曲林可能通過阻斷抑郁大鼠心肌肌漿網(wǎng)上功能異常RyR2受體，使得鈣釋放減少，從而減少大鼠房顫發(fā)生率，起到保護(hù)作用。

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