孤立性心房顫動的C反應(yīng)蛋白1441C/T多態(tài)性及其血清水平

錢志宏 倪悅 葛丹亙

心房顫動(簡稱房顫)患者血清C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度明顯增高[1-2]，CRP 作為一種非特異性的炎癥反應(yīng)指標, 在房顫發(fā)病中有一定的指導(dǎo)價值。CRP通過經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)，能與血管內(nèi)膜中的脂蛋白結(jié)合后，產(chǎn)生大量終末攻擊復(fù)合物，可氧化損傷心肌細胞和心房細胞，并且引起心房的結(jié)構(gòu)改變[3]，心肌發(fā)生纖維化改變，心電傳導(dǎo)功能發(fā)生異常，引起房顫的發(fā)生。CRP血清濃度越高，房顫發(fā)作可能性越大。

血清中CRP 是由外界環(huán)境因素與本身遺傳因素相互作用后的結(jié)果。Miller 等[4]通過基因組學(xué)研究表明CRP 基因變異對血清CRP 水平有35%～50% 的作用，而CRP基因1441C/T位于3′非翻譯區(qū)，能明顯影響基礎(chǔ)水平CRP分泌，并且在炎癥刺激下能升高 CRP濃度水平[5]。那么CRP多態(tài)性與房顫發(fā)病到底有無相關(guān)性呢？目前在國內(nèi)外缺少這兩者之間關(guān)系的研究。筆者就CRP1441C/T多態(tài)性與孤立性房顫(LAF)的發(fā)病風(fēng)險及與血清CRP濃度之間三者之間的關(guān)系進行探討。

1 資料與方法

1.1研究對象

本研究所有入選對象為蘇南地區(qū)的漢族人群，均為本院門診及住院患者，從2010年6月到2016年6月收集 LAF患者共116例，入組前均未行射頻消融術(shù)，行超聲心動圖左房直徑小于50 mm[(45.22±3.25)mm]，其中陣發(fā)性房顫54例，均為入組前30天內(nèi)有發(fā)作，且有明確的心電圖支持；持續(xù)性房顫62例。LAF入選標準：年齡小于60歲，未發(fā)現(xiàn)有明確病因和任何器質(zhì)性心臟病。其中男72例，女44例，年齡(52.82±3.85)歲作為病例組。選擇同期正常體檢112例，排除糖尿病和高血壓者，并詢問病史未有過陣發(fā)性心悸者(男70例，女42例)，年齡(51.10±4.68)歲作為對照組。所有入選對象排除嚴重肝、腎功能異常及甲狀腺功能亢進患者；并排除慢性炎癥性疾病(兩組中性粒細胞數(shù)及血沉無異常)。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會討論通過，所有入選對象均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1CRP基因1441C/T檢測 采用相應(yīng)的內(nèi)切酶進行酶切，上游引物為5′CCCTTCAGTCCTAATGTCC 3′，下游引物為5′GCTCTTGCCTTATGAGTTTT3′。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)體系為30 μl，包括：2X GoTaq Green Master Mix 15 μl，模板DNA 0.5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.75 μl，Nuclease-FreeWater 13ul ，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，然后按95℃ 30 s，52℃ 30 s， 72℃30 s進行36個循環(huán)，72℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μl，限制性內(nèi)切酶Hpych4III( NEB公司)酶切電泳，具體檢測方法參照本實驗室既往研究[6]。

1.2.2CRP濃度測定 病例組患者入院時，對照組體檢時抽取外周靜脈血2 ml，置入EDTA抗凝管，靜置2 h后，3 000 r/min，離心10 min，收集上層血清，放于-70℃冰柜保存待測。CRP濃度測定，采用ELISA試劑盒。ELISA試劑盒為人-hsCRP試劑盒；廠家：廈門慧嘉生物，貨號：EHJ-10173 h；檢測范圍：100～2 000 ug/L；變異范圍：批內(nèi)9% 、批間：11%，每個樣本測1次，正常人群血清CRP中位數(shù)范圍：0.58～1.13 mg/L。并嚴格按照試劑盒說明書進行操作，讀取光密度值，并計算其相應(yīng)濃度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

CRP1441C/T位點特異引物 PCR擴增得到 460 bp的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶 HpyCH4Ⅲ酶切后，由于HpyCH4Ⅲ可切割C基因型為311、149bp兩個片段，故可產(chǎn)生 3種基因型片段：野生型純合子 (CC)帶型為 311、149bp兩條條帶，雜合子(CT)帶型為 460、311和149bp 三條條帶，突變純合子(TT)帶型為 460bp一條條帶(圖1)。

2.2CRP基因型和等位基因頻率分布

病例組和對照組 CRP1441C/T基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡；兩組間CC、CT基因型頻率分布無差異(P=0．375)，僅在病例組發(fā)現(xiàn)一個TT基因型；等位基因頻率分布：兩組含T等位基因頻率也無差異(P=0．220)。見表 1。

表1 基因型與LAF關(guān)系

2.3兩組血清CRP水平

病例組血清CRP水平明顯高于對照組，亞組間比較：CC、CT+TT基因型病例組血清濃度明顯高于對照組；組內(nèi)比較時，亞組間CT+TT與CC基因型濃度無差異。見表2。

表2 血清CRP濃度比較 /(mg/L)

3 討論

房顫是臨床常見的快速型心律失常，其發(fā)生卒中風(fēng)險是正常人群4～6倍，死亡風(fēng)險是正常人群1～2倍，目前已知是一種炎癥反應(yīng)，炎癥在房顫的發(fā)生和維持中起著重要作用[7]。

人類CRP有206個氨基酸殘基組成，編碼CRP基因長約2250bp，有2個外顯子中間被一個內(nèi)含子分開，基因位于1號染色體長臂上[3]。Pankow 等[8]研究報道，遺傳因素對血清 CRP 水平所起的作用可達 35%～ 40%。CRP1441C/T 位于轉(zhuǎn)錄區(qū)，為功能性多態(tài)性位點，通過轉(zhuǎn)錄機制可影響血清中CRP濃度水平。但是，關(guān)于CRP1441C/T多態(tài)性對血清影響，目前國內(nèi)外此方面報道結(jié)論有部分差異。在國外的研究中，Shakhnovich 等[9]研究認為CRP1441C/T多態(tài)性TT純合子比C等位基因攜帶的血清CRP水平高；而Pai等[10]對1003例急性心肌梗死患者測試CRP濃度，未發(fā)現(xiàn)CRP1441C/T 多態(tài)性和血清 CRP 水平間有相關(guān)性。國內(nèi)朱名安等[11]檢測250例健康體檢者后，發(fā)現(xiàn)CRP1441C/T位點有T T 、CT 、CC3種不同基因型，在檢測CRP濃度后，發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型血清 CRP濃度明顯高于CC基因型；而Yan等[12]檢測128例冠心病患者和119例健康人群，卻只發(fā)現(xiàn)CT、CC兩種基因型，并且發(fā)現(xiàn)攜帶CC基因型的血清濃度高與CT基因型，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；而楊海濤等[13]檢測221例冠心病患者和161例健康人群，也僅僅發(fā)現(xiàn)CT、CC兩種基因型，攜帶CT基因型的血清濃度高與CC基因型，兩者也無統(tǒng)計學(xué)差異。

從本研究中可以看出，在檢測CRP濃度水平后，病例組CRP血清水平明顯大于對照組，且在兩組亞組中也得到了證實，說明血清 CRP濃度與LAF發(fā)病有相關(guān)性，CRP濃度越高越易發(fā)作LAF；組內(nèi)比較時，亞組間LAF組與對照組CT+TT基因型血清濃度高于CC基因型血清濃度，但兩者血清 CRP水平無統(tǒng)計差異，說明CRP1441C/T 多態(tài)性可能與CRP濃度有關(guān)；本研究檢測CRP1441C/T單核苷酸多態(tài)性后，比較兩組間基因型頻率分布及等位基因頻率分布，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異，但病例組CT基因型及含T等位基因多于對照組，且僅在病例組中發(fā)現(xiàn)TT一種基因型，說明CRP1441C/T 多態(tài)性可能與LAF有關(guān)；含有T等位基因的個體CRP血清濃度較高，這些與國內(nèi)Yan等[12]，楊海濤等[13]研究相一致，猜測可能由于發(fā)生T等位基因突變后，通過轉(zhuǎn)錄機制促進血清CRP水平分泌，引起CRP濃度增高，誘發(fā)LAF的發(fā)生。T突變等位基因可能會提高血清濃度，而C等位基因可能是一個保護因子。

本課題與國外研究存有差異，考慮與種族及地區(qū)人群環(huán)境差異有關(guān)。另外，本研究也存在一些缺陷：入選的研究對象量不大，所選的對照組只是正常健康體檢者，可能會有部分房顫患者。CRP1441C/T多態(tài)性與LAF的發(fā)病風(fēng)險及與血清CRP濃度之間三者之間的確切關(guān)系尚需擴大樣本量，聯(lián)合多中心多地區(qū)人群做進一步研究。

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