Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜3種氧化還原酶活性的影響

張 鼐，李裕紅，徐 佳

（廈門大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究中心，福建 廈門 361005）

隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展和礦產(chǎn)資源的大規(guī)模開發(fā)，生態(tài)環(huán)境特別是水體重金屬污染越來越嚴(yán)重，水體中的重金屬污染物通過食物鏈的積累和放大對生物產(chǎn)生更大的毒害作用。自然環(huán)境中的重金屬污染常常是2種或2種以上重金屬元素形成的復(fù)合污染，重金屬元素之間除表現(xiàn)出毒害增強(qiáng)的協(xié)同作用外，還表現(xiàn)出獨立、相加或拮抗作用。由于重金屬復(fù)合污染機(jī)制復(fù)雜、對環(huán)境的危害程度嚴(yán)重，因此，對重金屬復(fù)合污染的研究已成為近年來環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域重要的研究熱點[1]。

細(xì)胞質(zhì)膜是植物抵抗環(huán)境污染的第1道屏障，質(zhì)膜上的電子傳遞鏈通過質(zhì)膜氧化還原酶的作用及電子載體的氧化和還原反應(yīng)進(jìn)行電子傳遞，因此，質(zhì)膜氧化還原酶在植物的氧化還原系統(tǒng)中具有舉足輕重的地位，對植物抵抗環(huán)境污染也具有重要作用。該系統(tǒng)以NAD（P）H為電子供體，還原、EDTA-Fe3+和O2等，同時釋放 H+，此反應(yīng)過程在能量傳遞、營養(yǎng)和代謝物的運輸與吸收、生長發(fā)育、信息傳導(dǎo)及抗性解毒等方面起著重要作用[2]。

鳳眼蓮〔Eichhorniacrassipes（Mart.）So lm s〕又名水葫蘆，中文學(xué)名鳳眼藍(lán)，屬于雨久花科（Pontederiaceae）鳳眼藍(lán)屬（EichhorniaKunth）多年生水生草本植物，繁殖能力很強(qiáng)，條件適宜時擴(kuò)散蔓延速度極快，致使許多河流、湖泊阻塞，被列入惡性入侵雜草之列。然而，大量的研究表明，鳳眼蓮能有效吸收富營養(yǎng)水體中的氮和磷等營養(yǎng)元素，并對水體中的各種重金屬和有毒化合物等具有富集作用，是監(jiān)測和凈化水體污染的一種良好植物材料[3]；鳳眼蓮對單一的 Cd2+或 Zn2+脅迫均有較強(qiáng)的耐性和積累能力，且在凈化過程中其根部的作用最強(qiáng)[4-6]。目前，重金屬污染對鳳眼蓮影響的研究多是在單一重金屬脅迫條件下進(jìn)行的，且研究內(nèi)容大多集中于重金屬對鳳眼蓮細(xì)胞結(jié)構(gòu)[7]、形態(tài)和生長指標(biāo)[8]、光合作用生理指標(biāo)[9]、脂質(zhì)過氧化以及抗氧化生理指標(biāo)[9-10]等方面的影響。

作者采用水培法對鳳眼蓮幼苗進(jìn)行20 h及20 d的 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫，通過提取高純度質(zhì)膜微囊研究 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜3種氧化還原酶〔包括 NADH氧化酶、還原酶和 EDTA-Fe3+還原酶〕活性的影響，以期為利用鳳眼蓮修復(fù)重金屬復(fù)合污染水體提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試鳳眼蓮幼苗于2009年春季采自福建泉州洛陽江水域。選取同一區(qū)域生長均勻一致的鳳眼蓮幼苗〔單株鮮質(zhì)量為（98.9±12.4）g〕，用曝氣自來水在室內(nèi)暫養(yǎng)5 d后進(jìn)行單一及復(fù)合脅迫處理，暫養(yǎng)期間室內(nèi)溫度為12℃～25℃，在自然光照條件下進(jìn)行暫養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理方法 實驗設(shè)置3組處理，其中， Cd2+單一脅迫處理濃度為0.05和0.50mmo l·L-1；Zn2+單一脅迫處理濃度為0.5和5.0mmol·L-1；Cd2+-Zn2+復(fù)合脅迫設(shè)置4個處理組：0.5mmo l· L-1Zn2+-0.05 mmo l·L-1Cd2+，0.5 mmo l·L-1Zn2+-0.50 mmo l·L-1Cd2+，5.0 mmo l·L-1Zn2+-0.05 mmol·L-1Cd2+以及5.0 mmol·L-1Zn2+-0.50mmo l·L-1Cd2+。

在高15 cm、直徑35 cm的塑料盆中加入4 L培養(yǎng)水（為含0.5 g·L-1Ca2+的曝氣自來水）[11]，再分別一次性加入 CdC l2·2.5H2O和 ZnSO4·7H2O，使水中 Cd2+和 Zn2+的終濃度分別達(dá)到上述處理要求，對照組（CK）則為不添加 Cd2+和 Zn2+的培養(yǎng)水。每處理3盆，每盆4株鳳眼蓮幼苗，每盆視為1次重復(fù)。在各脅迫條件下培養(yǎng)20 h和20 d后，取鳳眼蓮幼苗的根系進(jìn)行分析。

1.2.2 根質(zhì)膜微囊的分離純化 采用差速離心水雙相分離法[12-13]提取鳳眼蓮根質(zhì)膜微囊。每個實驗組隨機(jī)取約20 g新鮮鳳眼蓮根，經(jīng)液氮研磨后，加入勻漿液（pH7.8）繼續(xù)研磨，過濾，濾液用 ROTINA38R型冷凍離心機(jī)（德國Hettich公司生產(chǎn)）于10000g離心15m in；棄沉淀，上清液用 A van ti J-25型高速冷凍離心機(jī)（美國Beckm an公司生產(chǎn)）于50000g離心30m in；棄上清液，沉淀用5 mmo l·L-1磷酸緩沖液（含0.1mmo l·L-1DTT和1mmo l·L-1KC l，pH7.8）懸浮，得到粗膜制劑。將粗膜制劑用兩相分配法進(jìn)行純化，先用 ROTINA38R型冷凍離心機(jī)于1500g離心15m in，上清液再用 Avanti J-30 I型超速冷凍離心機(jī)于100000g離心30m in，棄上清液，沉淀用純膜懸浮液（含5mmol·L-1Tris-Mes、0.1mmo l·L-1DTT和0.25mmo l·L-1蔗糖）懸浮，得到純化的根質(zhì)膜微囊，即用或置于-70℃冰箱保存、待用。

1.2.3 質(zhì)膜微囊蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán) G-250法測定鳳眼蓮根質(zhì)膜微囊的蛋白質(zhì)含量。具體實驗步驟按照Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天試劑公司生產(chǎn)）中的操作說明進(jìn)行操作，使用Genios-DNA多功能酶標(biāo)儀（瑞典 Tecan公司生產(chǎn)）測定鳳眼蓮根質(zhì)膜微囊蛋白質(zhì)含量，重復(fù)測定2次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 質(zhì)膜中3種氧化還原酶活性的測定 參照陳珈等[14]和焦新之等[15]的方法測定鳳眼蓮根質(zhì)膜中的NADH氧化酶活性（以NADH的氧化速率表示）、Fe（CN）63-還原酶活性〔以還原速率表示〕和 EDTA-Fe3+還原酶活性（以 EDTA-Fe3+還原速率表示）。其中，以波長340 nm處測定液消光系數(shù)的變化代表NADH氧化酶活性的變化，并按1mmol·L-1NADH的消光系數(shù)為6.23換算被氧化的NADH量；以波長420 nm處測定液消光系數(shù)的變化代表還原酶活性的變化，并按1mmol·L-1的消光系數(shù)為1換算被還原的量；以波長535 nm處測定液消光系數(shù)的變化代表 EDTA-Fe3+還原酶活性的變化，并參照亞鐵鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 EDTA-Fe3+的還原速率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用 Excel2003和 SPSS11.5軟件進(jìn)行分析處理，采用 Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性的影響

植物細(xì)胞質(zhì)膜中的NAD（P）H氧化酶是以胞質(zhì)NAD（P）H為電子供體、氧為天然電子受體、催化胞外氧生成超氧陰離子的氧化還原酶。實驗結(jié)果表明，鳳眼蓮幼苗的根質(zhì)膜上存在NADH氧化酶，且其活性受 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫的影響，但酶活性變化隨脅迫濃度和脅迫時間的不同而異，詳細(xì)實驗結(jié)果見表1。

表1 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 NADH氧化酶活性的影響（±SD）1）Table1 Effects of singleand com b ined stresses of Cd2+and Zn2+on NADH ox idase activ ity in root p lasm a lemm a of E ichho rn ia crassipes（Mar t.）Solm s（±SD）1）

表1 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 NADH氧化酶活性的影響（±SD）1）Table1 Effects of singleand com b ined stresses of Cd2+and Zn2+on NADH ox idase activ ity in root p lasm a lemm a of E ichho rn ia crassipes（Mar t.）Solm s（±SD）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P≤0.05）D ifferent sm all letters in same column indicate the significant difference（P≤0.05）.

濃度/mmol·L-1 Concen tration Zn2+ Cd2+不同脅迫時間的酶活性/mmol·mg-1·m in-1 Enzyme activity atdifferent stress times20 h 20 d0.0 0.00 0.059±0.006a 0.046±0.006e0.5 0.00 0.040±0.000c 0.166±0.008a5.0 0.00 0.035±0.004c 0.129±0.008b0.0 0.05 0.034±0.003c 0.096±0.004c0.0 0.50 0.036±0.006c 0.049±0.003e0.5 0.05 0.024±0.001d 0.043±0.005f0.5 0.50 0.035±0.001c 0.060±0.008e5.0 0.05 0.015±0.001e 0.076±0.014d5.0 0.50 0.044±0.008b 0.050±0.002e

由表1可見，脅迫20 h，Cd2+、Zn2+單一脅迫各處理組的鳳眼蓮根質(zhì)膜 NADH氧化酶活性均顯著降低。用0.5和5.0mmol·L-1Zn2+單一脅迫處理20 h，鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性分別較對照下降了32.2％和40.7％；用0.05和0.50 mmo l·L-1Cd2+單一脅迫處理20 h，鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜 NADH氧化酶活性較對照分別下降了42.4％和39.0％。脅迫處理20 d，0.5 mmo l·L-1Zn2+、5.0 mmol·L-1Zn2+和0.05mmol·L-1Cd2+3個脅迫處理組中鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶活性均顯著高于對照組（P≤0.05），其中，0.5和5.0mmol·L-1Zn2+脅迫處理組中鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性分別較對照組提高了260.9％和180.4％，0.05mmo l·L-1Cd2+脅迫處理組鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性較對照組提高了108.7％。

由表1還可見，在 Cd2+-Zn2+復(fù)合脅迫條件下， Cd2+或 Zn2+的存在均會在一定程度上改變Cd2+或 Zn2+對鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶活性的影響效應(yīng)。脅迫處理20 h，0.05或0.50mmol·L-1Cd2+與0.5mmo l· L-1Zn2+復(fù)合脅迫對鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性具有協(xié)同降低的作用，0.05mmol·L-1Cd2+與5.0 mmol·L-1Zn2+復(fù)合脅迫也對鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶活性具有協(xié)同降低的作用，但0.50mmo l·L-1Cd2+與5.0mmol·L-1Zn2+復(fù)合脅迫則使鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性的降幅減小，顯示出一定的拮抗作用；在0.5或5.0mmol·L-1Zn2+與0.05mmol·L-1Cd2+復(fù)合脅迫條件下鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性的降低幅度更大，也顯示出協(xié)同降低的作用。可見，Cd2+-Zn2+復(fù)合脅迫20 h對鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性的聯(lián)合作用與Cd2+、Zn2+的脅迫濃度有關(guān)。在Cd2+-Zn2+復(fù)合脅迫條件下處理20 d，鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性均小于 Zn2+單一脅迫處理組，表明 Cd2+的存在對0.5或5.0 mmo l·L-1Zn2+對鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜 NADH氧化酶活性的影響效應(yīng)有一定的拮抗作用；而 Zn2+的存在在一定程度上也會改變 Cd2+對鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性的影響效應(yīng)，其中，0.5或5.0mmo l·L-1Zn2+與0.05mmo l·L-1Cd2+復(fù)合脅迫條件下鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶活性均小于0.05 mmo l·L-1Cd2+單一脅迫處理組，0.5或5.0mmo l·L-1Zn2+與0.50mmo l·L-1Cd2+復(fù)合脅迫條件下鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶活性均大于0.50mmo l·L-1Cd2+單一脅迫處理組。

此外，表1的數(shù)據(jù)還顯示，Cd2+-Zn2+復(fù)合脅迫20 h，鳳眼蓮根質(zhì)膜 NADH氧化酶活性顯著降低；隨著脅迫時間的延長，NADH氧化酶活性有所提高，脅迫20 d后鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶活性明顯高于脅迫處理20 h，增加幅度最大的是5.0mmol·L-1Zn2+-0.05 mmo l·L-1Cd2+復(fù)合脅迫處理組，其根質(zhì)膜NADH氧化酶活性比脅迫20 h時增加了406.7％。在實驗濃度范圍內(nèi)，Cd2+、Zn2+單一脅迫20 h，Cd2+及較高濃度 Zn2+的單一脅迫均使鳳眼蓮根質(zhì)膜 NADH氧化酶活性顯著降低；而Cd2+、Zn2+單一脅迫處理20 d，鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜NADH氧化酶活性則明顯大于脅迫處理20 h。

2.2 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜 還原酶活性的影響

表2 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 Fe（CN）6 3-還原酶活性的影響（±SD）1）Table2 Effects of sing leand com b ined stresses of Cd2+and Zn2+on Fe（CN）63-reductase activ ity in root p lasm a lemm a of E ichho rn ia crassipes（Mar t.）Solm s（±SD）1）

表2 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 Fe（CN）6 3-還原酶活性的影響（±SD）1）Table2 Effects of sing leand com b ined stresses of Cd2+and Zn2+on Fe（CN）63-reductase activ ity in root p lasm a lemm a of E ichho rn ia crassipes（Mar t.）Solm s（±SD）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P≤0.05）D ifferent small letters in sam e co lum n ind icate the significan t d ifference（P≤0.05）.

濃度/mmol·L-1 Concentration Zn2+ Cd2+不同脅迫時間的酶活性/mmol·mg-1·m in-1 Enzym e activity at different stress tim es20 h 20 d0.0 0.00 0.084±0.036a 0.090±0.008e0.5 0.00 0.077±0.009a 0.323±0.015a5.0 0.00 0.069±0.006a 0.230±0.022b0.0 0.05 0.060±0.007b 0.176±0.009c0.0 0.50 0.057±0.006b 0.088±0.005e0.5 0.05 0.043±0.004bc 0.073±0.009f0.5 0.50 0.061±0.007b 0.108±0.005e5.0 0.05 0.027±0.002c 0.133±0.013d5.0 0.50 0.076±0.008a 0.088±0.004e

由表2數(shù)據(jù)可見，單一脅迫20 h，0.5和5.0mmol· L-1Zn2+脅迫處理組鳳眼蓮根質(zhì)膜還原酶活性較對照組變化不顯著，而0.05和0.50mmol·L-1Cd2+脅迫處理組鳳眼蓮根質(zhì)膜還原酶活性均較對照組顯著降低。隨脅迫時間的延長，鳳眼蓮根質(zhì)膜還原酶活性提高，脅迫20 d后各單一脅迫處理組根質(zhì)膜還原酶活性明顯高于脅迫20 h，除0.50mmo l·L-1Cd2+脅迫處理組與對照組無顯著差異外，其他單一脅迫處理組的 Fe（CN）63-還原酶活性均顯著高于對照組，其中，0.5 mmo l·L-1Zn2+脅迫處理組的 Fe（CN）63-還原酶活性增加幅度最大，比脅迫20 h時提高了319.5％。

由表2還可見，在 Cd2+-Zn2+復(fù)合脅迫條件下， Cd2+或 Zn2+的存在均會在一定程度上改變 Zn2+或Cd2+對鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜 Fe（CN）63-還原酶活性的影響效應(yīng)。與0.5mmol·L-1Zn2+單一脅迫處理組相比，脅迫20 d時0.05或0.50mmo l·L-1Cd2+與0.5mmol·L-1Zn2+復(fù)合脅迫處理組鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜 Fe（CN）63-還原酶活性分別下降了77.4％和66.6％，因而，脅迫20 d時0.05或0.50 mmo l·L-1Cd2+與0.5mmol·L-1Zn2+復(fù)合脅迫對 Fe（CN）63-還原酶活性具有明顯的拮抗作用；0.05 mmo l·L-1Cd2+與5.0 mmo l·L-1Zn2+復(fù)合脅迫20 h對 Fe（CN）63-還原酶活性具有明顯的協(xié)同降低作用，導(dǎo)致Fe（CN）63-還原酶活性降幅更大，但脅迫處理20 d后，該復(fù)合脅迫處理組鳳眼蓮根質(zhì)膜還原酶的活性盡管較對照組有所提高，但低于5.0 mmo l ·L-1Zn2+單一脅迫處理組，表明經(jīng)過較長時間的復(fù)合脅迫處理后，Cd2+對 Zn2+的影響效應(yīng)具有一定的拮抗作用。與0.05mmo l·L-1Cd2+單一脅迫處理組相比，脅迫20 h時 Zn2+與0.05mmo l·L-1Cd2+復(fù)合脅迫處理組鳳眼蓮根質(zhì)膜 Fe（CN）63-還原酶活性較對照組的下降幅度更大，表現(xiàn)為協(xié)同降低作用；但隨著脅迫時間延長，至脅迫20 d時，0.05 mmo l·L-1Cd2+單一脅迫處理組 Fe（CN）63-還原酶活性高于對照組，而 Zn2+與0.05mmo l·L-1Cd2+復(fù)合脅迫處理組則有所降低，顯示 Zn2+的存在對 Cd2+的影響效應(yīng)有一定的拮抗作用。

研究結(jié)果表明，在 Cd2+、Zn2+單一脅迫20 h時，由于急性毒性的原因，鳳眼蓮根質(zhì)膜 Fe（CN）63-還原酶活性低于對照，但隨脅迫時間的延長，鳳眼蓮根質(zhì)膜 Fe（CN）6

3-還原酶活性因受到脅迫刺激而增強(qiáng)。對鳳眼蓮根質(zhì)膜 Fe（CN）63-還原酶活性而言，Cd2+與 Zn2+的相互作用關(guān)系并非固定不變，而是隨脅迫濃度和脅迫時間不同呈協(xié)同或拮抗作用。

2.3 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性的影響

植物不能直接利用 Fe3+，只有當(dāng) Fe3+被還原成Fe2+或結(jié)合成螯合物時才能通過質(zhì)膜被細(xì)胞吸收[17]。實驗結(jié)果（表3）顯示，在鳳眼蓮根質(zhì)膜上存在 EDTA-Fe3+還原系統(tǒng)，Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性有影響。

表3數(shù)據(jù)表明，脅迫20 h，0.5和5.0mmo l·L-1Zn2+以及0.05和0.50mmo l·L-1Cd2+單一脅迫處理組鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性均顯著低于對照組，但隨脅迫時間延長其活性增加，至脅迫20 d時4個單一脅迫處理組鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTAFe3+還原酶活性比對照組分別提高了242.9％、209.1％、134.5％和29.0％。在實驗條件下，較高濃度Zn2+單一脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶的激活作用更大。脅迫處理20 h，0.05或0.50mmol·L-1Cd2+單一脅迫處理組鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性均顯著降低，分別較對照組降低了61.6％和62.0％；隨著脅迫處理時間的延長，鳳眼蓮根質(zhì)膜EDTA-Fe3+還原酶活性提高，脅迫20 d后0.05或0.50mmo l·L-1Cd2+單一脅迫處理組鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性分別比脅迫20 h時提高了3.71和1.62倍，并顯著高于對照組。Cd2+-Zn2+復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTAFe3+還原酶活性的影響效應(yīng)與單一脅迫處理完全不同。表3結(jié)果表明，0.5或5.0mmo l·L-1Zn2+無論是與0.05mmol·L-1Cd2+、還是與0.50mmo l·L-1Cd2+復(fù)合脅迫處理20 h，鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜 EDTAFe3+還原酶活性都顯著低于 Zn2+單一脅迫處理組，并顯著低于對照組；其中，0.05mmo l·L-1Cd2+與不同濃度 Zn2+復(fù)合脅迫導(dǎo)致 EDTA-Fe3+還原酶活性降低的幅度大于0.50 mmo l·L-1Cd2+與不同濃度Zn2+復(fù)合脅迫處理組；脅迫處理20 d時0.5或5.0 mmo l·L-1Zn2+單一脅迫導(dǎo)致鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性顯著高于對照，而 Cd2+-Zn2+復(fù)合脅迫處理則使 EDTA-Fe3+還原酶活性降低并接近對照水平，表明 Cd2+的存在對 Zn2+的影響效應(yīng)具有一定的拮抗作用。脅迫處理20 d時，Zn2+對 Cd2+所起的影響效應(yīng)有較明顯的作用，0.05 mmo l·L-1Cd2+單一脅迫導(dǎo)致鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性較對照組提高了134.5％，而0.5或5.0mmol ·L-1Zn2+與不同濃度 Cd2+復(fù)合脅迫可使 EDTAFe3+還原酶活性明顯降低，表明 Zn2+對 Cd2+的影響效應(yīng)具有一定的拮抗性。

表3 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性的影響（±SD）1）Table3 Effects of singleand com b ined stresses of Cd2+and Zn2+on EDTA-Fe3+reductase activ ity in root p lasm a lemm a of E ichho rn ia crassipes（Mar t.）Solm s（±SD）1）

表3 Cd2+、Zn2+單一及復(fù)合脅迫對鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性的影響（±SD）1）Table3 Effects of singleand com b ined stresses of Cd2+and Zn2+on EDTA-Fe3+reductase activ ity in root p lasm a lemm a of E ichho rn ia crassipes（Mar t.）Solm s（±SD）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P≤0.05）D ifferent small letters in same column indicate the significant difference（P≤0.05）.

濃度/mmol·L-1 Concentration Zn2+ Cd2+不同脅迫時間的酶活性/mmol·mg-1·m in-1 Enzyme activity atdifferent stress times20 h 20 d0.0 0.00 1.112±0.000a 0.858±0.021f0.5 0.00 1.043±0.025b 2.942±0.000a5.0 0.00 0.904±0.032c 2.652±0.048b0.0 0.05 0.427±0.015e 2.012±0.052c0.0 0.50 0.423±0.007e 1.107±0.027e0.5 0.05 0.368±0.032f 0.712±0.050g0.5 0.50 0.612±0.052d 1.094±0.067e5.0 0.05 0.248±0.000g 1.241±0.011d5.0 0.50 0.426±0.027e 0.890±0.029f

研究結(jié)果表明，無論 Cd2+、Zn2+單一脅迫還是復(fù)合脅迫，脅迫處理20 d時鳳眼蓮根質(zhì)膜 EDTA-Fe3+還原酶活性均顯著高于脅迫處理20 h，這一變化趨勢與鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶和還原酶活性的變化趨勢相似。

3 討論和結(jié)論

實驗結(jié)果表明，0.05或0.50mmo l·L-1Cd2+單一脅迫處理20 h可使鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶、Fe（CN）63-還原酶和 EDTA-Fe3+還原酶活性顯著低于對照，0.5或5.0mmol·L-1Zn2+單一脅迫處理20 h可導(dǎo)致鳳眼蓮根質(zhì)膜NADH氧化酶和 EDTAFe3+還原酶活性也顯著低于對照；但隨脅迫時間的延長，鳳眼蓮根質(zhì)膜氧化還原酶活性增加，無論是 Cd2+、Zn2+單一脅迫還是復(fù)合脅迫，脅迫20 d時鳳眼蓮根質(zhì)膜氧化還原酶活性均顯著高于脅迫處理20 h，可以認(rèn)為鳳眼蓮根質(zhì)膜氧化還原酶在抗 Cd2+、Zn2+脅迫生理過程中起重要作用。高活性的質(zhì)膜氧化還原酶可以促進(jìn)植物對鐵的吸收利用、促進(jìn)細(xì)胞壁的合成及H+的分泌、維持正常的膜電位、增強(qiáng)防御系統(tǒng)功能[18]。Cd2+和 Zn2+單一或復(fù)合脅迫影響鳳眼蓮根質(zhì)膜氧化還原酶活性的原因可能有以下幾個方面：1）植物細(xì)胞質(zhì)膜具有電子載體和多種氧化還原酶，能進(jìn)行電子傳遞、供體氧化和受體還原反應(yīng)，氧化還原反應(yīng)之間存在著直接的電子競爭[19]，Cd2+和 Zn2+對電子傳遞鏈某一環(huán)節(jié)的影響必定對氧化還原反應(yīng)之間存在的電子競爭關(guān)系造成影響；2）由于重金屬離子的加入影響了細(xì)胞質(zhì)膜的帶電性，從而造成了質(zhì)膜上與酶結(jié)合的底物濃度的變化[20]；3）在抗 Cd2+、Zn2+脅迫過程中，鳳眼蓮幼苗根質(zhì)膜氧化還原酶可能通過電子傳遞產(chǎn)生的活性氧激發(fā)質(zhì)膜上的自由基清除系統(tǒng)來適應(yīng)外源重金屬脅迫，這也體現(xiàn)了植物的氧化還原系統(tǒng)不但具有信號傳導(dǎo)功能同時也受到已知信號傳導(dǎo)途徑的影響[21]。

對鳳眼蓮根質(zhì)膜氧化還原酶而言，在脅迫處理20 h時，Cd2+與 Zn2+之間的聯(lián)合作用關(guān)系較復(fù)雜，隨濃度不同而呈現(xiàn)協(xié)同性或者拮抗性，并非是固定不變的作用關(guān)系。因此，在探索重金屬復(fù)合污染環(huán)境下各重金屬元素之間的相互作用關(guān)系時既要考慮共存元素的性質(zhì)又要考慮濃度比例[22]。本研究結(jié)果顯示， Cd2+、Zn2+聯(lián)合作用效應(yīng)與 Cd2+和 Zn2+的元素性質(zhì)、濃度比例及脅迫時間均有關(guān)，表現(xiàn)較為一致的是：在脅迫20 d時 Zn2+對 Cd2+或者 Cd2+對 Zn2+的作用均體現(xiàn)出拮抗性，即 Cd2+與 Zn2+之間具有拮抗作用關(guān)系。由于 Zn2+能夠與蛋白質(zhì)中的巰基結(jié)合，而 Cd2+與巰基的結(jié)合產(chǎn)物比 Zn2+更穩(wěn)定，因此，Cd2+可以把Zn2+從巰基中置換出來，表現(xiàn)為 Cd2+對 Zn2+的拮抗作用[3]。另外，通常情況下游離態(tài)的 Cd2+對生物體的毒性較大，但如果 Cd2+與蛋白質(zhì)結(jié)合形成 Cd-硫蛋白，毒性就會明顯降低，而鳳眼蓮體內(nèi) Zn2+含量較高，可對 Cd2+有較好的解毒效果，有助于鳳眼蓮對Cd2+的吸收，使鳳眼蓮在 Cd2+、Zn2+共存時對 Cd2+的耐受性增強(qiáng)，因此表現(xiàn)出拮抗作用關(guān)系。

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