北五味子藥材指紋圖譜研究

　　摘要：目的：為提高五味子藥材的質(zhì)量控制水平，建立北五味子藥材的HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行方法學(xué)考察。方法：用HPLC方法，在檢測波長250nm下，以五味子醇甲為對照品，采用甲醇(A)、水(B)二元流動相進(jìn)行梯度洗脫建立北五味子藥材的HPLC指紋圖譜。結(jié)果：在檢測波長250nm下，北五味子藥材共有8個共有色譜峰，且以甲醇(A)、水(B)二元流動相梯度洗脫的條件下，供試品出峰較多，色譜峰分離度良好，所建立的指紋圖譜更具代表性。另對10個批次五味子藥材指紋圖譜進(jìn)行了相關(guān)性考察及聚類分析，結(jié)果表明共有色譜峰相似系數(shù)均在0.999以上，10批樣品間具有較高的相似度，可以繼續(xù)擴(kuò)大樣品范圍、數(shù)量?？捎糜诮⒈蔽逦蹲拥牡赖厮幉牡腍PLC指紋圖譜模型并提高五味子藥材的質(zhì)量控制水平。結(jié)論：此方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，且簡便可行，可用于五味子藥材的質(zhì)量控制；
　　關(guān)鍵詞：北五味子；HPLC指紋圖譜；相似度；聚類分析
　　中圖分類號：R284.1
　　文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
　　文章編號：1007－2349(2010)06－0058－04
　　
　　中藥指紋圖譜是以系統(tǒng)的化學(xué)成分或藥理學(xué)研究為基礎(chǔ)，采用化學(xué)測定或基因鑒定得到某種或某產(chǎn)地中藥(制劑)所共有的、具有特異性的組分群體(某類或數(shù)類成分)特征圖譜或圖象。利用現(xiàn)代先進(jìn)的分析技術(shù)來分析藥材的整體特性，更準(zhǔn)確地鑒別不同中藥及識別中藥本身的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣。指紋圖譜研究在質(zhì)量評價方面應(yīng)用的關(guān)注程度逐漸加強，可借助中藥指紋圖譜鑒別真?zhèn)嗡幉募俺善?，評價原料藥材、半成品和成品質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性，目前對指紋圖譜在中藥材及中成藥上的應(yīng)用研究十分活躍，經(jīng)常采用的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法。
　　
　　本試驗采用高校液相色譜法建立五味子藥材指紋圖譜，分別對不同產(chǎn)地的五味子藥材中木脂素類成分加以分析研究。探討綜合地控制五味子藥材質(zhì)量的方法，力求建立一種分析速度快、方法重現(xiàn)性好的指紋圖譜研究方法，以提高五味子藥材的質(zhì)量控制水平，以更全面地保證藥材質(zhì)量，并為五味子的道地藥材規(guī)范化研究提供基礎(chǔ)研究資料。
　　
　　1　儀器與試藥
　　
　　電子天平(島津AT220)，紫外一可見分光光度計(島津uv－265Fw)，超聲波清洗器(上海必能信CQ－250)，高效液相色潛儀(美國安捷倫Agilent1100)。五味子醇甲對照品(批號：886200001，購自中國藥品生物制品檢定所)。甲醇(色譜純)、重蒸餾水，其他試劑均為分析純。10批五味子藥材分別采集于遼寧省新賓滿族自治縣五味子基地、丹東、桓仁、本溪等地，經(jīng)本院植物教研室王冰教授鑒定，均為正品藥材，藥材來源見表1。
　　
　　2　實驗方法與結(jié)果
　　
　　2，1　色譜條件　色譜柱：安捷倫C(4.6×150mm)檢測波長：250nm；流速：1.0mL／min。流動相：采用甲醇(A)、水(B)二元流動相進(jìn)行梯度洗脫，流動相變化情況見表2。
　　2，2　對照品溶液的制備　取五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1mL含0.2mg的溶液，搖勻，即得。
　　2，3　供試品溶液的制備　取不同批次的五味子藥材粉碎，過三號篩，取粉末0.5g，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇約20mL，超聲處理(功率250w，頻率33kHz)20min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
　　
　　2，4　HPLC圖譜繪制　分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，在前述色譜條件下，繪制液相色譜圖。測定結(jié)果提示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置處，其有相同保留時間色譜峰，并標(biāo)定了8個與相鄰組分分離度良好的共有色譜峰。
　　2，5　方法學(xué)考察
　　2，5，1　精密度試驗考察　取同一供試品溶液(樣品號1)，精密吸取10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，以各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的變化情況，考察試驗方法與儀器的精密度。考察結(jié)果見表3、表4。
　　試驗結(jié)果表明：主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的比值沒有明顯變化，儀器方法精密度良好。
　　2，5，2　穩(wěn)定性試驗考察　取同一份供試品溶液(樣品號1)，精密吸取10μL，分別在0、2、4、6、8h進(jìn)樣分析，考察各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積比值，結(jié)果見表5、表6。
　　測定結(jié)果表明：8h內(nèi)樣品色譜峰面積無明顯變化，其組分化學(xué)物質(zhì)穩(wěn)定。
　　2，5，3　重復(fù)性試驗考察　取五味子藥材(樣品號1)5份，精密稱定。按上述供試品溶液及測定方法進(jìn)樣操作，考察各主要色譜峰的相對保留時間和色譜峰的比值。測定結(jié)果見表7、表8。
　　結(jié)果表明：方法重復(fù)性良好。
　　
　　3　指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)
　　
　　3，1　共有峰的標(biāo)定　取不同來源五味子藥材(表2)，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液備10／zL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，得到不同來源五味子藥材的HPLC色譜圖。在選定的色譜條件下，以五味子醇甲色譜峰的保留時間與峰面積值為參照，確定基準(zhǔn)為1，分別計算不同批次五味子藥材的色譜峰相對保留時間和相對峰面積的比值，根據(jù)色譜峰在不同樣品中的共有率，結(jié)合成分分析和HPLC色譜圖分析，標(biāo)定了8個共有色譜峰，共有峰的相對保留時間(平均值)依次為1、1.4、1.8、2.0、3.1、3.5、4.3、4.6h。試驗結(jié)果見表9。
　　
　　3，2　共有峰面積比值　以供試品色譜中五味子醇甲的色譜峰面積面積作為1，計算各共有峰的相對峰面積。結(jié)果見表10。
　　測定結(jié)果提示：不同樣品中相對峰面積差異較大，表明不同來源五味子藥材之間質(zhì)量差異較大。
　　3，3　相似度考察
　　3，3，1　譜峰匹配　本實驗根據(jù)樣品相對保留時間，結(jié)合樣品指紋圖譜的譜峰形狀特點對標(biāo)定的共有峰進(jìn)行匹配，共標(biāo)定8個共有峰。
　　3，3，2　相似度計算　采用平均矢量法對10個批次五味子藥材指紋圖譜建立共有模式，作為對照指紋圖譜，將每張指紋圖譜與其進(jìn)行比較，并計算各個樣本與基準(zhǔn)樣本的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)，得到各圖譜與對照指紋圖譜的相似度。分析結(jié)果見表11。
　　結(jié)果可見，10個批次五味子藥材指紋圖譜的共有色譜峰相似系數(shù)均在0.999以上，表明10批樣品間具有較高的相似度。同來源鑒別的結(jié)果基本一致，可以繼續(xù)擴(kuò)大樣品范圍、數(shù)量，以建立北五味子的道地藥材的HPLC指紋圖譜模型。
　　3，3，3　10批五味子藥材指紋圖譜聚類分析　選用平方歐氏距離作為樣本間相似度測度，對樣品的相對保留時間數(shù)據(jù)、相對峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用組間連接法為聚類方法對樣品進(jìn)行歸類。分類結(jié)果見圖1。
　　采用平方歐氏距離作為測度，進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)的正態(tài)轉(zhuǎn)換，按組間分析法將五味子藥材分為2大類，樣品(7、9號樣品)和平均樣品(11號)的距離較小。由聚類分析結(jié)果可知，可以根據(jù)不同樣品與平均樣品(基準(zhǔn)樣品)的距離值或利用相似系數(shù)對五味子藥材樣品進(jìn)行定性鑒別分析。對于提高五味子藥材質(zhì)量控制水平、保證藥材質(zhì)量提供了有益的參考。
　　
　　4　結(jié)論
　　
　　本實驗建立五味子藥材指紋圖譜，在選定的色譜條件下，以五味子醇甲對照品色譜峰為參照，根據(jù)在不同樣品中色譜峰的出現(xiàn)頻率，結(jié)合成分分析和HPLC色譜圖分析，選定8個共有色譜峰，共有峰的相對保留時間依次為1、1.4、1.8、2.0、3.1、3.5、4.3、4.6h?？梢酝ㄟ^對樣品的共有峰采用聚類分析方法進(jìn)行研究，初步確定北五味子藥材的標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)。
　　通過五味子藥材指紋圖譜研究可以看出，雖然同一地區(qū)的藥材有相同保留時間的共有峰，但峰面積的比值有較大不同，說明同是作為北五味子藥材入藥使用，但在成分含量等質(zhì)量評價指標(biāo)上仍存在差異。
　　本實驗采用HPLC－紫外檢測法標(biāo)定8個共有峰，經(jīng)采用五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲隨行對照，已確定其中3個共有峰的歸屬，由于時間與對照品的限制，還需深入研究五味子藥材中其它共有峰的歸屬，以更好的控制藥材質(zhì)量。
　　本實驗對提取溶劑進(jìn)行了考察，分別試用乙醇、甲醇溶液作為提取溶劑，結(jié)果表明乙醇作為提取溶劑，所得色譜峰信息量較多。在樣品粉碎粒度和超聲提取時間上也進(jìn)行了考察。曾試用甲醇－水(55：45)、甲醇－乙腈－水(10：35：55)、乙腈－水(45：55)、乙腈－水(1：1)等流動相系統(tǒng)進(jìn)行篩選，結(jié)果表明乙腈－水(1：1)為流動相時，色譜峰峰形對稱，分離度良好。本實驗對流動相洗脫條件進(jìn)行了篩選，先后采用不同比例的甲醇－水洗脫系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，同現(xiàn)行藥典規(guī)定的含量測定項下流動相種類相同。而且在此流動相條件下，供試品出峰較多，色譜峰分離度良好，因此確立作為本實驗流動相系