低溫石油烴降解菌L HB16的篩選及降解特性

李 兵,張慶芳,竇少華,孫子羽,王 羽,遲乃玉

(1.大連大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116622;2.大連輕工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

低溫石油烴降解菌L HB16的篩選及降解特性

李 兵1,張慶芳1,竇少華1,孫子羽1,王 羽2,遲乃玉1

(1.大連大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116622;2.大連輕工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

自盤錦油田低溫環(huán)境土樣中分離到 1株低溫菌,該菌能以石油烴為唯一碳源和能源。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和 16S rDNA序列鑒定:菌株LHB16為嗜麥芽窄食單胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia)。紫外分光光度法測(cè)定該菌在含石油 0.5%(w/v)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,20℃,振蕩培養(yǎng) 10 d,降解率達(dá) 80.16%。經(jīng)傳代培養(yǎng)數(shù)代,降解性能穩(wěn)定。GC-MS分析表明烷烴 C15～C32被完全降解。菌株 LHB16在低溫地區(qū)石油污染的生物治理中有良好的應(yīng)用前景。

低溫;石油降解;篩選;Stenotrophomonasmaltophilia

極端環(huán)境微生物是目前微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。低溫菌是極端微生物之一,根據(jù)其生長(zhǎng)溫度特性分為嗜冷菌 (Psychrophilies)和耐冷菌 (Psychrotrophs)兩類。其中嗜冷菌是指必須生活在低溫條件下,在 0℃環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖,最適溫度不超過(guò) 15℃,最高溫度不超過(guò) 20℃的微生物;耐冷菌是指能在低溫條件下生長(zhǎng),在 0℃～5℃可生長(zhǎng)繁殖,最高溫度可達(dá) 20℃以上的微生物[1]。這兩類微生物的生態(tài)分布和低溫生物學(xué)特性均存差異,它們以獨(dú)特的生理功能適應(yīng)環(huán)境,研究這類微生物不僅具有重要的理論意義,而且在實(shí)際應(yīng)用上已經(jīng)產(chǎn)生了日益明顯的經(jīng)濟(jì)意義。利用低溫菌對(duì)寒冷地區(qū)石油污染進(jìn)行治理,已引起學(xué)者們廣泛興趣。歐、美、澳,加、日[2-6]等國(guó)對(duì)低溫石油降解微生物的研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足發(fā)展,而我國(guó)與此相關(guān)的研究則剛起步。本文就低溫石油降解微生物的選育及其降解特性進(jìn)行了報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2009年 4月采自遼河油田鉆井機(jī)旁被填理油泥、油砂和附近土壤。

1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:NaCl 10 g,NH4Cl 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41.0 g,MgSO40.5 g,CaCl20.02 g,KCl 0.1 g,FeCl2·4H2O 0.02 g,自來(lái)水 1000 ml,pH自然。

富集培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 +原油 5 g。

分離培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 +原油 5 g+瓊脂18 g

斜面培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

甘油保存培養(yǎng)基:50%甘油:種子液 =1:1,-25℃低溫保存。

1.3 降解菌的富集和篩選

取 10 g石油污染土樣加入裝有 l00 ml富集培養(yǎng)基的 250 ml三角瓶中,20℃,150 rpm,搖床培養(yǎng) 10 d。取 10 ml富集培養(yǎng)液同條件培養(yǎng),重復(fù)二次。用接種環(huán)蘸取富集液在分離培養(yǎng)基上劃線分離。挑取生長(zhǎng)速度快,生長(zhǎng)良好的菌落在牛肉膏蛋白胨固體平板上劃線純化。

1.4 石油含量的測(cè)定

采用紫外分光光度法[7]測(cè)定降解體系中殘油量。

1.5 殘油組分 GC-MS檢測(cè)

以石油醚提取殘油組分。采用美國(guó) GCMS聯(lián)用儀 (HP 6890/5973)進(jìn)行分析。GCMS運(yùn)行條件:色譜柱:HP-5 MS,30 m ×0.25 mm ×0.25μm,配 F ID檢測(cè)器,N IST譜庫(kù)。進(jìn)樣口溫度:300℃;柱溫:60℃恒溫 1 min,以 8℃/min升至 220℃,再以 2℃/min升至 300℃,最后停留 25 min。載氣為高純氦 (99.99%),流速為 1 ml/min。進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣,分流比為 100:1。進(jìn)樣量 1μl。

1.6 菌株的鑒定

生理生化特征鑒定參考[7-8]。16S r DNA擴(kuò) 增 采 用 TaKaRa16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit,擴(kuò)增產(chǎn)物送寶生物 (大連)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在 NCB I上與已知 16S r DNA序列進(jìn)行同源性比較,在 16S r DNA序列分析的基礎(chǔ)上,采用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[10-11]。通過(guò)以上方法對(duì)菌株鑒定到種。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離和篩選

將樣品富集,涂平板,分離得到 100株低溫石油降解菌,經(jīng)復(fù)篩得到 1株能利用石油為唯一碳源和能源的細(xì)菌,命名為 LHB16。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

將復(fù)篩得到的 1株菌進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表 1。

表 1 菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)菌株 LHB16的 16S r DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,經(jīng)過(guò)3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得約 1.5 kb大小的產(chǎn)物(圖 2)。PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序,16S rDNA序列長(zhǎng) 1508 bp。使用 Blast進(jìn)行序列同源性比較[12],菌株 LHB16與 Stenotrophomonas maltophilia(AY040357)同源性100%。圖 1顯示菌株 LHB16與 Stenotrophomonas maltophilia(AY040357)進(jìn)化距離最小。

綜合菌株 LHB16的形態(tài)特征、生理生化和 16S rDNA鑒定結(jié)果,參考文獻(xiàn)[7-8]將菌株 LHB16鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia)。

圖 1 菌株 LHB16系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖 2 菌株 LHB16 PCR產(chǎn)物,M:DL2,000 DNA Marker,1:PCR產(chǎn)物

2.3 石油降解率測(cè)定

在 20℃條件下,振蕩培養(yǎng) 10 d,接種量2%(V/V)時(shí),菌株 LHB16降解率達(dá) 80.16%,傳代培養(yǎng)數(shù)代,同條件測(cè)定,其石油降解率為82.16%。略有提高 (＜1%),表明石油降解性能穩(wěn)定。

2.4 殘油組分的 GC-MS檢測(cè)結(jié)果

以 2%接種量將菌 LHB21接入富集分離培養(yǎng)基中,20℃,150 rpm恒溫培養(yǎng) 10 d,用石油醚提取殘油并濃縮,以不接菌處理做對(duì)照,對(duì)菌LHB16降解后殘油 GC-MS分析 (圖 3,4)。對(duì)照組經(jīng)檢測(cè)含有 C15～C3218種烷烴;菌株LHB16對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度的烴類降解效果不同,石油降解程度隨碳鏈增長(zhǎng)而降低,C15～C32直鏈烷烴被完全降解,殘油中未降解的組分(C22,C25-C29)主要為長(zhǎng)鏈支鏈烷烴和雜環(huán)芳香烴。

圖 3 對(duì)照殘油 GC-MS圖譜

圖 4 菌 LHB16降解后殘油 GC-MS圖譜

3 結(jié)論

(1)通過(guò)對(duì)遼河油田低溫石油樣品富集分離,篩選得到 1株低溫石油降解菌,命名為L(zhǎng)HB16,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察,生理生化鑒定和 16s r DNA序列分析將菌株 LHB16鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia)。

(2)LHB16菌株對(duì)石油具有良好的降解特性,該菌在石油濃度為 5 g/L,接種量 2%(V/V)、pH自然、溫度 20℃條件下,接種 10 d后對(duì)石油的降解效率可達(dá) 80%以上

(3)菌株 LHB16,能完全降解 C15～C34長(zhǎng)鏈烷烴。

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Screen ing of a psychrotrophic oil-degrading Stra in LHB16 and ItsDegradation Characteristics

L IBing1,ZHANGQing-fang1,DOU Shao-hua1,SUN Zi-yu1,WANG Yu2,CH INai-yu1
(1.Bioengineering College,Dalian University,Dalian,116022,China;;2.School ofBiological and Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,116034,China)

A psychrotrophic strain,designated LHB16,utilizing oil as the sole carbon source,was isolated from the soil and identified as Stenotrophomonasmaltophilia based on physiological,biochemical tests and 16S r DNA sequence.The ultraviolet spectrophotometric deter mination indicated that strain LHB16 could remove 80.16%of oil at 0.5% (w/v)concentration in 10 d at 20℃,The GC-MS analysis revealed that longchain alkanes from C15 to C32 in the oil were completely depleted.The study implied thatLHB21 is a valuable biodegradation strain deserving further attention.

psychrotroph;oil degradation;screening;Stenotrophomonasmaltophilia

X172 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):

1008-2395(2010)06-0072-03

2010-10-23

國(guó)家"973項(xiàng)目"(No.2007CB707801);國(guó)家"863計(jì)劃"(No.2007AA021306);遼寧省自然科學(xué)基金(No.2050775)

李兵 (1983-),男,碩士,Email:cny7566@126.com