原子力顯微鏡的原理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用

李艷青 智麗麗

(1,2.昌吉學(xué)院物理系 新疆 昌吉 831100)

原子力顯微鏡的原理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用

李艷青1智麗麗2

(1,2.昌吉學(xué)院物理系 新疆 昌吉 831100)

本文簡(jiǎn)述了原子力顯微鏡的工作原理及其工作模式,并且闡述了每種工作模式的優(yōu)缺點(diǎn),著重介紹了原子力顯微鏡在生命科學(xué)中所發(fā)揮的重要作用,并指出了原子力顯微鏡在研究生物樣品過程中所存在的問題,以及原子力顯微鏡在生命科學(xué)中的發(fā)展前景。

原子力顯微鏡;工作模式;應(yīng)用

1 引言

光學(xué)顯微鏡的出現(xiàn)使人們能夠觀察到用肉眼看不到的物質(zhì)細(xì)節(jié),如生物細(xì)胞,因此它已經(jīng)成為生命科學(xué)研究必不可少的重要工具。但是普通的光學(xué)顯微鏡的分辨率受到衍射極限的限制,不可能分辨比λ/2(λ為光波波長(zhǎng))更小的物體,其分辨率的極限只能達(dá)到 4×10-7m,最大放大倍數(shù)只有 2000。隨后發(fā)明的電子顯微鏡雖然具有非常高的分辨率,但它難以精確地揭示物質(zhì)的表面微觀結(jié)構(gòu),其復(fù)雜的制樣要求限制了其在活性生物分子等方面的研究應(yīng)用。到了二十世紀(jì)八十年代,Binning和 Rohrer[1]發(fā)明了掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope,ST M),隨后,在掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)上又發(fā)展起來了其他各種新型掃描探針型表面分析儀器 (SPM),原子力顯微鏡就是其中的一種。掃描探針顯微鏡(SPM)集光電子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)高速采集和控制,以及高分辨率圖形處理于一體,利用探針與樣品之間的電、光、磁力、熱等物理關(guān)系,獲得樣品表面和內(nèi)部信息。

1986年誕生了原子力顯微鏡 (atomic force microscope,AFM)[2],這種高分辨率的掃描探針顯微鏡能夠應(yīng)用到包括絕緣體在內(nèi)的各種樣品研究中。

2 原子力顯微鏡的工作原理及工作模式

2.1 原子力顯微鏡的工作原理

原子力顯微鏡(AFM)是Binnig等人在 ST M的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的掃描探針顯微鏡,它利用原子之間的范德華力來呈現(xiàn)樣品的表面特性,可獲取納米級(jí)分辨率的活生物體等表面結(jié)構(gòu)信息。

AFM有一個(gè)對(duì)力非常敏感的微懸臂,其尖端有一個(gè)微小的探針,當(dāng)針尖與樣品表面接觸的時(shí)候,針尖與樣品表面上的原子之間存在一個(gè)非常微弱的相互作用力使微懸臂彎曲,該形變信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)楣怆娦盘?hào)并進(jìn)行放大,就可以得到原子之間相互作用力的信號(hào)。AF M通過測(cè)量探針針尖與樣品表面原子間力的大小來描繪樣品的表面形貌,它不受樣品是否具有導(dǎo)電性的限制,可以對(duì)導(dǎo)體、半導(dǎo)體和絕緣體進(jìn)行測(cè)量,因此AFM的出現(xiàn)補(bǔ)償了 ST M不能觀測(cè)絕緣體的缺陷,為生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展做出了很大貢獻(xiàn)。圖1為AFM工作原理及儀器結(jié)構(gòu)示意圖。

2.2 原子力顯微鏡的工作模式

根據(jù)原子間作用力(引力或斥力)的不同,AFM成像分為接觸模式(Contact mode AFM,C-AFM)、非接觸模式 (Non-Contact mode AFM,NC-AFM)和輕敲模式 (Inter mittent-contact(tapping mode) AFM,T M-AFM)三種工作模式,如圖 2。

接觸模式中,針尖和樣品表面之間的距離僅有幾個(gè)埃,針尖與樣品之間的作用力在范德華力的排斥區(qū)域。非接觸模式中,針尖與樣品表面之間的距離是 50-100埃,針尖與樣品之間的作用力在范德華力的吸引區(qū)域。當(dāng)針尖與樣品之間的作用力在范德華力的吸引和排斥區(qū)域之間的時(shí)候,此工作模式被稱為輕敲模式,針尖與樣品表面之間的距離大約是 10-50埃。圖 3為原子間的 Lennard-Jones曲線,在圖中可以看出有三個(gè)區(qū)域:(l)接觸區(qū)域,代表的是AF M接觸模式;(2)非接觸區(qū)域,代表AFM非接觸模式;(3)在接觸區(qū)和非接觸區(qū)兩者之間區(qū)域,代表 T M-AFM模式。

圖 3 原子間力一距離曲線

接觸模式下,針尖前端的單個(gè)原子與樣品表面的單個(gè)原子之間存在排斥力,敏感的微懸臂因?yàn)榕懦饬Πl(fā)生彎曲。利用這一現(xiàn)象可以測(cè)量出原子間接近時(shí)的相互排斥力,一般可以測(cè)得兩個(gè)原子之間的力為 10-8N左右。接觸的情況下由于摩擦力的存在可以引起懸臂的偏轉(zhuǎn),不同的摩擦力使懸臂的偏轉(zhuǎn)不同,運(yùn)用該特點(diǎn)可以來檢測(cè)針尖與樣品表面之間摩擦力的大小,一般可以測(cè)得摩擦力的大小 10-11N左右。此模式下,針尖與樣品的距離比較近,成像的分辨率高。但是,當(dāng)掃描軟樣品時(shí),針尖和樣品表面強(qiáng)的排斥力會(huì)造成樣品原子位置的改變,引起軟樣品的損傷;同時(shí),軟樣品的原子容易粘附在探針針尖上,污染針尖不利于成像,所以,接觸模式一般不適合掃描軟樣品,例如:生物大分子、低彈性模量以及容易移動(dòng)和變形的樣品。

非接觸模式下針尖與樣品表面距離較遠(yuǎn),相互作用力較弱,有利于研究軟生物樣品。但是,該模式下針尖與樣品之間的距離較遠(yuǎn),分辨率相比接觸模式和輕敲模式將降低,而且成像很不穩(wěn)定,操作相對(duì)困難,在生物研究中很少使用。

處在兩者之間的被稱為輕敲模式(Tapping mode AFM,T M-AFM)。輕敲模式類似于非接觸模式,但是,輕敲模式下微懸臂的共振頻率的振幅比較大,一般在 20nm左右,AFM的針尖在振蕩的時(shí)候與樣品的表面只是輕輕接觸,因此被稱作輕敲模式。由于輕敲模式能夠避免針尖粘附到樣品上,以及在掃描過程中對(duì)樣品幾乎沒有損壞,所以輕敲模式可以對(duì)液體中活性生物樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、對(duì)溶液反應(yīng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)跟蹤等。

3 原子力顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用

原子力顯微鏡(AF M)不僅僅能對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行觀測(cè),而且還能對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行自由操縱[3]。到目前為止AFM的研究已從原子、小分子、有機(jī)分子、高分子直至生物分子,涉及到生物技術(shù)、微探測(cè)及納米技術(shù)、微電子技術(shù)、實(shí)際生產(chǎn)等方面,其在物理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)以及微電子學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用前景,特別是在生物大分子的觀察與操縱方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。

原子力顯微鏡已經(jīng)在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[4]。自從 Lindsay等人首次用 AFM獲得DNA分子的圖像以來,AFM已經(jīng)成為研究DNA分子的重要工具。Hans ma等人首次在丙醇中得到了質(zhì)粒DNA可重復(fù)的AFM圖像,他們通過AFM切割遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸分子的指定位置,這是人們第一次利用AFM對(duì)生物分子進(jìn)行的可控制性的納米操縱[5]。vesenka等人[6]在大氣的環(huán)境下獲得了脫氧核糖核酸的重復(fù)性的AF M圖像。最近幾年以來,通過改善AFM樣品制備方法,改進(jìn)探針針尖的分子修飾,更重要的通過 T M-AFM成像,一些科研工作者獲得超分辨的DNA以及DNA的復(fù)合物的圖像[7]。目前,原子力顯微鏡還不能解決DNA分子的核苷酸序列,但是,通過原子力顯微鏡已經(jīng)研究出了高級(jí)DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物,并且可以研究單個(gè)DNA分子的長(zhǎng)度、寬度和高度。Martin等人[8]用AF M實(shí)時(shí)觀察到了環(huán)狀和棒狀DNA聚合體的自組裝、DNA聚合體的運(yùn)動(dòng)和結(jié)構(gòu)的變化過程。

首先用原子力顯微鏡研究的蛋白質(zhì)是 halobacterium halobim的紫膜上的視紫紅蛋白[9]。對(duì)于一些游離蛋白質(zhì),科學(xué)家們也在這方面獲得了很大的成功,例如:膠原蛋白、免疫蛋白、肌動(dòng)蛋白、蛋白聚合酶和巨球蛋白等等[10]。由于AFM能在液體和近生理?xiàng)l件下獲得高分辨的形貌圖,因此,在蛋白質(zhì)成像方面得到了廣泛的應(yīng)用,主要有:研究蛋白分子形狀的改變,觀察蛋白質(zhì)的微觀內(nèi)部構(gòu)造,探索蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)過程,實(shí)時(shí)觀測(cè)蛋白質(zhì)的自組裝過程,進(jìn)行原子力顯微鏡的單分子操縱、檢測(cè)蛋白質(zhì)的表面特性等[11-13]。

原子力顯微鏡在多糖方面的研究起步比較晚,多糖都具有很大的分子量,支鏈較多,在溶解方面比較困難,均一性較差,因此,形貌圖的效果比較差,分辨率低。但是,最近原子力顯微鏡在多糖方面的研究取得了很大進(jìn)展[14]。馬秀俐等人[15]利用原子力顯微鏡觀測(cè)到西洋參多糖的分子鏈為多股形狀并且緊密并行螺旋排列,每股螺旋直徑約為 200-250nm左右。Round等人[16]利用原子力顯微鏡研究了果膠多糖的支鏈結(jié)構(gòu)和相互交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),支鏈的存在直接影響果膠多糖的粘度性質(zhì),即便在很低的濃度下,仍然可以看到單個(gè)聚集體的存在。李艷青等人[17]利用原子力顯微鏡研究了多糖黃原膠分子,觀測(cè)出該糖微觀結(jié)構(gòu)隨溫度和退火時(shí)間有著規(guī)律性的變化,為生物體組織再造提供了一個(gè)有效的途徑。

以上實(shí)驗(yàn)均通過AFM得到高分辨率的形貌圖像,由于原子力顯微鏡可在液態(tài)環(huán)境中工作,所以AFM可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)其動(dòng)態(tài)生化反應(yīng),分辨率橫向高達(dá) 10-10×10-11m,這些圖像利用電子顯微鏡是不易觀察到的。

4 原子力顯微鏡研究生物樣品時(shí)存在的問題

原子力顯微鏡雖能夠觀測(cè)到單個(gè)原子,但這是受一定的條件制約的,在觀測(cè)生物大分子時(shí),遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到這樣的分辨率,主要原因在于進(jìn)行原子力顯微鏡掃描時(shí)一般采用輕敲模式,該模式下幾乎無法得到原子量級(jí)的圖像,如果利用接觸模式,對(duì)生物樣品會(huì)存在損害。另一方面,針尖的曲率半徑是影響原子力顯微鏡分辨率的一個(gè)重要因素,經(jīng)過幾十年的發(fā)展,新型碳納米管針尖可以大大改善針尖曲率半徑對(duì)分辨率的影響。因此碳納米管針尖是AFM探針的未來發(fā)展的一個(gè)重要方向。

通常情況下原子力顯微鏡的掃描速度比較低,需要幾分鐘的時(shí)間才能得到一個(gè)高分辨率的圖像。然而,對(duì)于很多的化學(xué)反應(yīng)都是在很短的時(shí)間內(nèi)完成的,因此,原子力顯微鏡不能實(shí)時(shí)觀測(cè)化學(xué)反應(yīng)的變化,有待科學(xué)界進(jìn)一步探究。

5 結(jié)論與展望

AFM在不同的工作模式,不同的環(huán)境下可以得到生物的表面形貌,表面特性以及動(dòng)力學(xué)過程等信息,它已經(jīng)成為研究生命科學(xué)領(lǐng)域中不可缺少的有力工具,隨著研究的深入,必將促進(jìn)生物科學(xué)進(jìn)入新的發(fā)展時(shí)代。

近年來,隨著科學(xué)技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展,許多新的 AFM工作模式 (如磁場(chǎng)操作模式 MACAFM)[18]不斷涌現(xiàn),使得AFM所得圖像更接近于真實(shí)圖像,而且,對(duì)樣品破壞程度大大降低。另一方面,AFM與其他技術(shù)聯(lián)用(如電子顯微鏡),將會(huì)進(jìn)一步提高對(duì)生命科學(xué)的研究能力,AFM的功能以及應(yīng)用范圍也將不斷的擴(kuò)大和深入,必將推動(dòng)科學(xué)的巨大進(jìn)步。

[1]G.Binnig,H.Rohrer,C.Gerber,E.Weibel.Appl.Phys.Lett.,1982,40:178.

[2]G.Binning,C.F.Quate,C.Gerber,Phys.Rev.Lett.,1986,56:930.

[3]H.G.Hansma et al.,Science,1992,256:1180.

[4]G.U.Lee,L.A.Chrisey.,Science,1994,266:771.

[5]H.G.Hansma,J.Vesenka,C.Siegerist.et al,Science,1992,256:1180.

[6]J.Vesenka,M.Guthold,C.L.Tang.et al,Ultramicroscopy,1992,42-44:1243.

[7]Han W,Lindsay S M,Dlakic M,Harrington R E.nature,1997,386:563.

[8]A.L.Martin,M.C.Davies,B.J.Raekstraw.et al,.FEBS Letters,2000,480:106

[9]Butt H J,Downing K H,Hans ma P K.Biophysical J,1990,58:1473.

[10]Arakawa H,Umemura K,Ikai A.Nature,1992,358:171.

[11]G.M.Hand,D.J.Muller,B.Nieho1Son.et al,J.Mol.Biol,2001,315:587.

[12]M.KamermanS,I.Fahrenfort,K.SchultZ.et al,Science,2001,292:1178.

[13]J. I.Kourie,H.B.Wood.Prog,Biophys.Mol.Biol,2000,73:91.

[14]Kirby A R,Gunning A P.Morris V J.biopolymers.1996,38:355.

[15]馬秀俐,白玉白,劉忠英等.西洋參多糖(PPQ-d)的原子力顯微鏡觀察[J].吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2000,(1): 105.

[16]Round A N,Rigby N M.et al,Carbohydrate Research.2001,331:337.

[17]Yanqing Li. et al,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 2009,74:136.

[18]Ge G,Han D,Lin D.et a1,Ultramicroscopy,2007,107:299.

O561.1;TG115.21+5.7

A

1671-6469(2010)03-0112-05

2010-05-17

昌吉學(xué)院院級(jí)課題(2010SSQD021和 2010SSQD020)

李艷青 (1982-),男,河南省項(xiàng)城市人,昌吉學(xué)院物理系,助教,研究方向:原子力顯微鏡對(duì)生物大分子的研究。

(責(zé)任編輯:代琴)