大鼠右肝門靜脈結(jié)扎磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像

黃丙倉，詹松華，耿道穎*，譚文莉，楊爍慧

1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院放射科，200040

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院放射科，200021

磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging, DWI)與磁共振波譜、灌注成像是研究功能及微觀影像學(xué)的重要工具之一。最初用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是超急性期腦梗死、腦腫瘤及癲癇等疾病[1]。由于呼吸及心臟搏動的影響，在肝臟的應(yīng)用受到限制。最近，由于平面回波技術(shù)的應(yīng)用，生理性運(yùn)動偽影基本可以被凍結(jié)，DWI在肝臟的應(yīng)用逐漸開展[2]。肝硬化、肝炎、肝性腦病、肝膿腫及各種肝臟占位性病灶DWI研究及臨床應(yīng)用已獲得了較大的進(jìn)展[3-7]。肝腫瘤治療后發(fā)生壞死及殘存腫瘤組織的DWI表現(xiàn)及表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient, ADC)值測量已有報道[8,9]，但是前瞻性研究發(fā)生灶性凋亡的肝細(xì)胞DWI表現(xiàn)及ADC值測量尚未見報道。本文通過大鼠肝門靜脈結(jié)扎的方法來促使肝細(xì)胞發(fā)生灶性凋亡，研究凋亡的DWI表現(xiàn)及ADC測量值定量研究。

1 材料與方法

1.1 動物手術(shù)及分組

選取體重300 g左右的SD大鼠30只，雌雄各半，3%戊巴比妥(1 ml/kg)腹腔麻醉，中下腹部剪毛后，在嚴(yán)格無菌條件下打開腹腔，將胃及腸管慢慢提起至于切口外，用濕紗布覆蓋，然后在顯微鏡下順著肝胃韌帶及肝十二指腸韌帶找到門靜脈右分支進(jìn)行鈍性分離，并用0號線兩次結(jié)扎確保門靜脈血供完全中斷。然后將腹部臟器完全回位關(guān)腹。術(shù)后將30只大鼠隨機(jī)分成5組，每組6只。

1.2 磁共振檢查序列及參數(shù)

實(shí)驗大鼠MRI檢查采用Marconi 1.5 T Edge EclipseTMMR成像儀，腕關(guān)節(jié)環(huán)形表面線圈(外直徑為12 cm，內(nèi)直徑約為9 cm)為接收線圈。大鼠麻醉后右側(cè)臥位，將肝臟部位置于線圈中央，并用膠布固定，然后調(diào)整墊子高度以保證大鼠上腹部位于磁場中心位置，定位片獲得后，行常規(guī)冠狀位FSE序列T2WI，TR/TE=4000/80 ms，層厚3.0 mm， FOV 13.0 cm，矩陣192×256，信號激勵次數(shù)為2。然后行橫斷位T1WI、T2WI，TR/TE=450/12.0 ms及TR/TE=4000/80 ms，層厚2.0 mm， FOV 11.0 cm，矩陣192×256，信號激勵次數(shù)為2；橫斷位DWI：TR/TE=∞/135.5 ms，b值設(shè)為100、300、500 s/mm2。

1.3 病理學(xué)及電鏡檢查

MRI和DWI檢查結(jié)束后，先取電鏡標(biāo)本，寫明樣本包埋要求，然后擇期進(jìn)行半薄定位、電鏡觀察及取片，將有明顯細(xì)胞核固縮的觀察野做好標(biāo)記，進(jìn)行電鏡觀察、分析。

在電鏡取材完成后，立即置于10%福爾馬林溶液中固定24 h以上，取肝右葉與左葉組織分切后常規(guī)石蠟包埋。將石蠟組織塊進(jìn)行5 μm連續(xù)切片，隨機(jī)抽取病理白切片分別做常規(guī)HE染色、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測細(xì)胞凋亡。TUNEL染色，采用德國DAKO公司生產(chǎn)的ApopTag S7100試劑盒，按照試劑盒附帶的染色操作步驟進(jìn)行，以細(xì)胞核呈深棕紅色伴核皺縮的細(xì)胞為細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞，否則為陰性。

1.4 ADC值測量及統(tǒng)計學(xué)方法

表1 各組病灶側(cè)與對照側(cè)T1WI、T2WI信號值及ADC測量值、rADC值

在T1WI肝左葉上編輯直徑為3.0 mm的一個感興趣區(qū)(ROI)，在同一層面上我們在T2WI肝右葉上編輯同樣大小的一個ROI，然后采用同層復(fù)制的方法在不同b值的DWI圖像上加以復(fù)制，分別測量病灶側(cè)及對照側(cè)T1WI、T2WI、DWI信號值，運(yùn)用公式ADC=ln(S1/S2)/(b2-b1) 算出ADC測量值，S1、S2是不同彌散敏感系數(shù)(b1、b2)條件下彌散加權(quán)圖像的信號強(qiáng)度。同樣的方法測量3次取其平均值作為ROI的ADC值。ROI應(yīng)避開血管、腹壁脂肪組織和含氣肺組織。統(tǒng)計學(xué)方法，采用配對t檢驗比較對照側(cè)與病灶側(cè)的差異，各組之間的差異采用兩因素隨機(jī)區(qū)組方差分析進(jìn)行兩兩比較，統(tǒng)計水平為P=0.05，統(tǒng)計軟件為SPSS 10.0。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝門靜脈結(jié)扎的病理變化

30只大鼠門靜脈右分支結(jié)扎后，肝右葉顏色稍變暗(圖1)，3天后肝右葉開始發(fā)生萎縮，以14天最為顯著，而肝左葉發(fā)生代償性肥大改變(圖2)。HE染色可見術(shù)后3小時肝右葉肝細(xì)胞出現(xiàn)少量核固縮肝細(xì)胞，此后各時間組固縮肝細(xì)胞漸增多(圖3)，3天后局部肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性及水樣變性，7天后肝細(xì)胞發(fā)生彌漫性水樣變性，胞漿內(nèi)見較多水泡。14天后肝細(xì)胞水泡變性部分融合，肝細(xì)胞膜部分破裂。TUNEL染色術(shù)后3小時可見少量散在的染成棕黃色的凋亡細(xì)胞，此后各組陽性細(xì)胞漸增多，呈灶性分布(圖4)。電鏡檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后3小時組開始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，此后各組凋亡細(xì)胞見增多，可見典型的核邊集改變(圖5)，細(xì)胞膜及質(zhì)膜完好無損，線粒體變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，部分凋亡細(xì)胞周邊可見凋亡小體(圖6)。7天后各組肝小葉之間可見小葉間膽管及纖維組織增生改變。

圖7 術(shù)后3天磁共振T1WI，肝右葉呈高信號(箭頭)；

圖8 磁共振T2WI，呈片狀高信號(箭頭)；

圖9 術(shù)后3天DWI，肝右葉呈小片狀高信號(箭頭)；

圖10 圖9相應(yīng)的ADC圖，肝右葉呈片狀低信號(箭頭)

2.2 肝細(xì)胞小灶性凋亡的T1WI、T2WI及DWI表現(xiàn)

術(shù)后各組在T1WI肝右葉信號較左側(cè)增高(圖7)，3小時組T2WI呈片狀低信號，此后各組呈片狀高信號(圖8)，3小時組DWI呈低信號，24小時后各組均呈片狀高信號(圖9)，ADC圖表現(xiàn)正好同DWI表現(xiàn)相反(圖10)。

2.3 病灶側(cè)與對照側(cè)T1WI、T2WI信號值及ADC測量值

由表1可見，右肝門靜脈結(jié)扎各組病灶側(cè)與對照側(cè)ADC值經(jīng)配對t檢驗，P值均小于0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。各組rADC之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

3.1 磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像原理

彌散是指分子的隨機(jī)側(cè)向運(yùn)動，即布朗運(yùn)動。DWI成像時在自旋回波(spin echo, SE)T2加權(quán)序列180°脈沖前后加上兩個對稱的彌散敏感梯度脈沖，對于靜止(彌散低)的水分子，第一個梯度脈沖所致的質(zhì)子因自旋去相位作用，會被對稱的第二個梯度脈沖再聚焦，信號不降低；而對于運(yùn)動(彌散強(qiáng))的水分子，第一個梯度脈沖所致的質(zhì)子自旋去相位發(fā)生后。很快離開了原來的位置，不能被第二個梯度脈沖再聚焦，導(dǎo)致信號降低。根據(jù)Fick定律，真正的彌散是由于濃度梯度導(dǎo)致的分子凈運(yùn)動，在磁共振成像中，濃度差異造成的分子運(yùn)動和壓力梯度、熱效應(yīng)以及離子的相互作用引起的分子運(yùn)動無法區(qū)分，因而只用ADC來表示機(jī)體中所測到的彌散，實(shí)際上是指設(shè)備所能測量的較明顯的彌散運(yùn)動的綜合體現(xiàn)。ADC值增大，代表水分子彌散增加，而彌散加權(quán)圖像信號降低，反之亦然[10]。

b值及b值差的選擇對于DWI及ADC值的測量非常重要，不同b值及b值差對ADC值能夠產(chǎn)生影響[10,11]。ADC值不僅受水分子彌散的影響，也受毛細(xì)血管網(wǎng)中血液的影響，當(dāng)梯度因子b較小(＜100)時，彌散效應(yīng)對信號的衰減作用非常小，ADC值受灌注的影響很大；隨著梯度因子b的增加(＞500)，DWI上的圖像對比度可更多地反映水分子彌散效應(yīng)。但是b值太大，信噪比及圖像質(zhì)量均下降[12]。

本次實(shí)驗中采用100、300、500三個b值，隨著b值增加，由于微循環(huán)的影響減少致使ADC值漸降低，特異性增加，但敏感性及信噪比卻下降。其中b值為300圖像信噪比最高。

3.2 凋亡動物模型的建立及磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像表現(xiàn)

凋亡是活體內(nèi)單個或小團(tuán)細(xì)胞死亡，可以是生理性的，也可以是病理性的。是細(xì)胞的程序性死亡，死亡細(xì)胞的質(zhì)膜不破裂，不引發(fā)死亡細(xì)胞的自溶，也不引起急性炎癥反應(yīng)。缺血缺氧程度較輕時可加速細(xì)胞的凋亡過程發(fā)生，筆者在前期的大鼠動物實(shí)驗研究中通過單純門靜脈結(jié)扎已成功建立了肝細(xì)胞凋亡動物模型[13]。本次實(shí)驗筆者研究右肝門靜脈結(jié)扎后，肝右葉合并小團(tuán)狀凋亡的磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像表現(xiàn)。凋亡模型建立后各時間組T1WI呈高信號，3小時組T2WI呈低信號，24小時后各組呈高信號，DWI呈片狀高信號。這些表現(xiàn)可能的機(jī)制是右肝門靜脈結(jié)扎后，肝右葉血量相對結(jié)扎前減少了約75%，蛋白濃度相對增高，致使T1WI表現(xiàn)為片狀高信號，與肝左葉分界清晰；由于肝右葉血量突然減少，含水量亦減少，因而3小時組T2WI為低信號，但24小時后由于肝動脈血流緩沖效應(yīng)[14]及肝細(xì)胞部分水樣變性，其含水量又增加，因而此后各組T2WI表現(xiàn)為高信號。DWI各組均表現(xiàn)為片狀高信號，可能原因有：①肝右葉門靜脈分支結(jié)扎后，由于血量減少，肝細(xì)胞濃度相對增高，因而水分子彌散受限，DWI信號增加；②肝門靜脈結(jié)扎后，肝血竇輕度淤血改變，也使水分子彌散受限；③3天后肝細(xì)胞開始發(fā)生水泡變性，肝細(xì)胞性水腫也是彌散受限原因之一；④由于門靜脈結(jié)扎，微循環(huán)的影響減小，致使信號增加。結(jié)合筆者前期肝右葉門靜脈及肝動脈全部阻斷DWI變化，發(fā)現(xiàn)肝右葉門靜脈單扎DWI信號介于正常肝右葉與全部阻斷血供后肝右葉信號之間。

3.3 凋亡的ADC測量值、rADC值及其隨b值的變化

以往的文獻(xiàn)[15,16]認(rèn)為發(fā)生凋亡時，其ADC值是增加的。筆者在肝腫瘤放療后誘發(fā)凋亡實(shí)驗中[17]，腫瘤區(qū)域的ADC值也是增加的。但是本次實(shí)驗中各組病灶側(cè)ADC測量值均較對照側(cè)減低，病理學(xué)HE染色、TUNEL染色及電鏡均證實(shí)肝右葉門靜脈結(jié)扎后確實(shí)發(fā)生灶性凋亡。分析原因，實(shí)驗結(jié)果與文獻(xiàn)并不矛盾，主要的原因是對照組的差別，只能選取自身對照，但是肝左葉同門靜脈結(jié)扎后的肝右葉比較，由于肝右葉含血量減少及其細(xì)胞密度的相對增加，以及后期合并少量空泡變性及小片中央靜脈旁壞死等，肝右葉ADC值要低于肝左葉的ADC值。肝右葉發(fā)生灶性凋亡后肝細(xì)胞間隙增大及細(xì)胞數(shù)量的減少所致的ADC值增加遠(yuǎn)遠(yuǎn)被前述肝右葉含血總量銳減所致的ADC值減低所遮蓋。但是，筆者采用rADC值卻能夠反映出肝右葉門靜脈結(jié)扎后隨著時間的變化情況，同時rADC值還可以去除微循環(huán)及b值的影響。rADC值的變化趨勢同各組TUNEL染色結(jié)果變化一致，表明rADC值可以活體反映本實(shí)驗中肝右葉發(fā)生灶性凋亡的情況。

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