SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的表達及其抗藥活性＊

郭小兵,張志堅,閻志勇,張欽憲

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科鄭州 450052 2)鄭州大學第三附屬醫(yī)院檢驗科鄭州 450052 3)鄭州大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室鄭州 450001 4)鄭州大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1953年 3月生,碩士,教授,研究方向:分子生物學,E-mail:qxz53@zzu.edu.cn

SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的表達及其抗藥活性＊

郭小兵1),張志堅2),閻志勇3),張欽憲4)#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科鄭州 450052 2)鄭州大學第三附屬醫(yī)院檢驗科鄭州 450052 3)鄭州大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室鄭州 450001 4)鄭州大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1953年 3月生,碩士,教授,研究方向:分子生物學,E-mail:qxz53@zzu.edu.cn

SHV;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶;抗藥活性

目的:原核表達 SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 (ESBLs)并分析其抗藥活性。方法:收集 2006年至 2007年鄭州大學第一附屬醫(yī)院分離 ESBLs大腸埃希菌 46株,采用 PCR克隆目的基因,采用基因重組技術構建 pET28a-SHV質(zhì)粒,采用 JM109大腸埃希菌作為宿主菌進行 ESBLs的表達,采用液體稀釋法檢測其最小抑菌質(zhì)量濃度(M I C)。結果:pET28a-SHV質(zhì)粒 PCR擴增條帶在約 900 bp位置處,其序列分析結果正確;頭孢噻肟與頭孢噻肟/克拉維酸抑菌環(huán)直徑差 >5 mm;pET28a-SHV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子對頭孢唑啉、慶大霉素及阿米卡星耐藥 (M I C均 >6 mg/L),對氨曲南、左氧氟沙星中介耐藥(M I C分別為 16及 8 mg/L),對廣譜青霉素和三代頭孢菌素體外敏感,對藥物酶抑制劑及亞胺培南穩(wěn)定敏感。結論:SHV型 ESBLs表達成功,轉(zhuǎn)化子對抗菌藥物體外敏感率較高。

目前,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 (extended spectrum β-lactamase,ESBLs)是革蘭陰性桿菌,尤其是大腸埃希菌廣泛耐藥的主要機制。在已知的 ESBLs諸多型別中,SHV型是較早發(fā)現(xiàn)的酶型之一,世界各地均有一定程度的流行[1]?；诳咕幬飸昧晳T差異,不同地域攜帶 SHV型 ESBLs大腸埃希菌菌株抗藥活性存在差異,故明確當?shù)?SHV型 ESBLs抗藥譜,對于臨床合理應用抗菌藥物、有效抗感染治療意義重大。SHV型 ESBLs在鄭州地區(qū)也較為常見,不同醫(yī)院均有一定的報道[2]。為明確該地區(qū) SHV型 ESBLs的抗藥活性,從而為臨床治療提供可靠的實驗室依據(jù),作者采用基因重組技術進行相關研究,報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源、主要試劑及儀器 參考文獻[3]。1.2 目的基因克隆 按照質(zhì)粒提取試劑盒操作提取質(zhì)粒。依據(jù) SHV型 ESBLs基因序列,利用DNAstar分析軟件,設計并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成特異性引物,上游引物 5’-CCTTT GAGATGGTGACAA-3’,下游引物 5’-GTTACAGC CCTTCGGCGA-3’,擴增產(chǎn)物大小為877 bp。以所提質(zhì)粒為模板,采用 50μL反應體系進行 PCR擴增,同時設立敏感菌株為對照。擴增程序為:94℃預變性 5 min;94℃50 s,55℃40 s,72℃50 s,共 30個循環(huán);最后 72℃延伸 5 min。然后將擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳(80 V,1 h),觀察結果。

1.3 載體構建、轉(zhuǎn)化及鑒定 采用B amHⅠ及XhoⅠ酶分別對 PCR擴增產(chǎn)物及 pET-28a空質(zhì)粒進行雙酶切,膠回收酶切產(chǎn)物,采用 T4連接酶連接目的基因片段和 pET-28a空質(zhì)粒,所得反應液直接轉(zhuǎn)化 JM109大腸埃希菌。在含卡那霉素的 LB平板上,挑選陽性菌落,PCR擴增目的條帶,有預測的陽性條帶出現(xiàn)者,則采用雙脫氧鏈終止法進行序列分析鑒定。同時采用頭孢噻肟/克拉維酸和頭孢噻肟酶抑制劑增強試驗進行轉(zhuǎn)化子確證。

1.4 pET-28a-SHV的原核表達及耐藥譜分析 將轉(zhuǎn)化子接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,35℃200 r/min振蕩培養(yǎng) 2 h后,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達14～18 h。取1mL菌液稀釋至0.5麥氏比濁管濁度,加入腸桿菌科細菌鑒定藥敏反應卡,37℃孵育18 h,上機檢測最小抑菌質(zhì)量濃度(M I C)。

2 結果

2.1 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 PCR擴增結果及序列分析 見圖1。約 900 bp處可見陽性條帶。序列分析結果與bla SHV(GenBank:EF125011)比對后顯示,所克隆基因為 SHV型 ESBLs基因序列。

2.2 轉(zhuǎn)化子確證檢測 見圖 2。兩者抑菌環(huán)直徑差 >5 mm,提示轉(zhuǎn)化子成為產(chǎn) ESBLs菌株。

2.3 pET-28a-SHVM IC檢測結果 見表 1。

表1 pET-28a-SHVM I C檢測結果 mg/L

3 討論

SHV型 ESBLs是由革蘭陰性菌產(chǎn)生,由質(zhì)粒介導,屬于Bush分類 2be組,分子生物學A類酶。資料[4-5]顯示,各 SHV亞型均由 SHV-1型廣譜內(nèi)酰胺酶發(fā)生點突變后而來,在氨基酸序列上常表現(xiàn)為酶蛋白結構中 1～4個氨基酸點突變?；诓煌瑏喰烷g抗藥活性有所差異,明確各亞型耐藥譜,對于臨床抗菌治療極為重要。

各 SHV亞型間突變位點均處于核苷酸中間位置,兩端序列極為保守,采用一對特異性引物即可擴增全部亞型 。作者采用基因重組技術,構建pET28a-SHV表達載體,并完成其體外表達及耐藥活性分析。

由M IC檢測結果可知,轉(zhuǎn)化子表達 ESBLs,對頭孢唑啉耐藥(M IC>16 mg/L),對氨曲南、左氧氟沙星中介耐藥 (M I C分別為 16及 8 mg/L),對廣譜青霉素(包括氨芐青霉素、派拉西林)和三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟)體外敏感,對酶抑制劑藥物及亞胺培南穩(wěn)定敏感。此外,轉(zhuǎn)化子對氨基糖苷類藥物慶大霉素及阿米卡星均表現(xiàn)為耐藥 (M IC>16 mg/L)。因 JM109大腸埃希菌為基因重組菌,其本身無耐藥活性,故考慮此耐藥性由 SHV型 ESBLs引起,具體機制有待于進一步研究。

基于同一質(zhì)粒不同宿主菌體內(nèi)表達狀況有所差異,為取得理想的表達效果,作者在預實驗中將構建好的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 TG1、BL21及 JM109大腸埃希菌,結果發(fā)現(xiàn) TG1、BL21轉(zhuǎn)化子無表達,JM109轉(zhuǎn)化子經(jīng)酶抑制劑增強試驗確證宿主菌已成為產(chǎn) ESBLs菌株,由M IC檢測結果可知,所產(chǎn)酶抗藥活性差于野生菌?？赡芘c野生菌本身具有多種耐藥機制和轉(zhuǎn)化子存在著基因丟失現(xiàn)象、表達質(zhì)粒數(shù)目較少及產(chǎn)物量過少有關[7-8]。

[1]李虹玲,劉文恩.SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的研究進展[J].實用預防醫(yī)學,2007,14(1):253

[2]馮羨菊,張燕,羅予.多藥耐藥腸桿菌科細菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型研究 [J].中華醫(yī)院感染學雜志, 2010,20(12):1 651

[3]張志堅,閻志勇,張欽憲.鄭州地區(qū)大腸埃希菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型分布[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版, 2010,45(5):730

[4]向倩,游學甫,蔣建東.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的分子生物學研究進展[J].中國醫(yī)學科學院學報,2006,28(2):298

[5]熊自忠,朱德妹,汪復,等.產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌中 SHV型β內(nèi)酰胺酶的分子生物學研究 [J].中國抗感染化療雜志,2003,3(4):194

[6]張志堅,郭小兵,張欽憲.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌 300株去巰基型基因檢測 [J].鄭州大學學報:醫(yī)學版, 2008,43(2):373

[7]李慧,李家斌.合肥市 54株產(chǎn) CTX-M型 ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性分析[J].中國感染與化療雜志,2006,6(2):112

[8]程君,王迎迎,李慧,等.合肥市產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株的 SHV型耐藥基因分布和耐藥性分析[J].中國藥理學通報,2007,23(6):812

Expression and antibiotic susceptibilities of SHV type extended-spectrum β-lactamase

GUO Xiaobing1),ZHANG Zhijian2),YAN Zhiyong3),ZHANG Q inxian4)1)Departm ent of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 4500522)Departm ent of ClinicalLaboratory,the Third Affiliated Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 4500523)Departm ent of Hum an Anatom y,College of B asicM edical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 4500014)Departm ent of Histology and Em bryology,College of B asic M edical Sciences, Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

SHV;extended spectrumβ-lactamase;antibiotic susceptibility

Ai m:To express SHV type extended spectrumβ-lactamase(ESBLs),and detect antibiotic susceptibilities. Methods:A total of 46 strains producing ESBLsE.coliwere collected from the first affiliated hospitalof Zhengzhou university.Slecting SHV ESBLs gene by PCR,using gene recombination techinique to construct pET28a-SHV,expressing SHV in JM109E.coliand detecting antibiotic susceptibilities by liquid dilution test.Results:The amplying productwas at 900 bp in agarose electrophoresis,the DNA sequence was right,the inhibition zone difference in disc diffusion test bet ween Cefotaxime and Cefotaxime/clavulanic acidwasmore than 5mm.Transfor mantwas resistant to cefazolin,gentamicin and amikacin(M IC≥16 mg/L),and itwas inter mediate to aztreonam and levofloxacin(M IC=16,and 8 mg/L).Transformant was sensitive to penbritin,third generations of cephalosporins.And it was sensitive to beta-lactamase inhibitors and imipenem.Conclusion: The expression of SHV ESBLs had been successful,and transformant ismore sensitive than wild strain to antibacterials.

R446.5

＊河南省醫(yī)學科技攻關基金資助項目 200703071

(2010-04-13收稿 責任編輯趙秋民)