甲磺酸伊馬替尼對游離二氧化硅粉塵激活大鼠肺成纖維細(xì)胞效應(yīng)的影響

邵苗苗,王 威,姚 武,張光輝,郝長付

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室鄭州 450001

甲磺酸伊馬替尼對游離二氧化硅粉塵激活大鼠肺成纖維細(xì)胞效應(yīng)的影響

邵苗苗,王 威,姚 武#,張光輝,郝長付

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1962年 8月生,教授,研究方向:職業(yè)性肺部疾患,E-mail:yaowu@zzu.edu.cn

甲磺酸伊馬替尼;二氧化硅;肺成纖維細(xì)胞;Ⅰ型膠原;Ⅲ型膠原;大鼠

目的:觀察甲磺酸伊馬替尼 ( IM)對游離二氧化硅 (SiO2)粉塵刺激所致大鼠肺成纖維細(xì)胞 (LF)激活過程的影響。方法:以游離 SiO2粉塵工作液對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞 (AM)染毒 24 h,離心收集其培養(yǎng)上清。陽性對照組用該培養(yǎng)上清刺激大鼠 LF,3個實驗組在培養(yǎng)上清中分別加入終濃度為 0.2、1.0和 5.0μmol/L的 IM后處理大鼠 LF,陰性對照用未經(jīng) S iO2刺激的AM上清培養(yǎng) LF;24 h后,收集各組培養(yǎng)上清,使用MTT法檢測LF細(xì)胞存活情況,用 RT-PCR方法檢測 LFα-平滑肌肌動蛋白 (α-S MA)、Ⅰ型膠原 (COLⅠ)及Ⅲ型膠原 (COLⅢ)mRNA的表達(dá)水平,用 EL ISA法測定培養(yǎng)上清中的 COLⅠ和 COLⅢ蛋白,用 BradFord法測定培養(yǎng)上清中的總蛋白。結(jié)果:5組存活細(xì)胞比例、α-S MA mRNA、COLⅠmRNA及蛋白、COLⅢmRNA及蛋白和總蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=3.571、3.904、18.686、6.582、28.983、8.555和 9.918,P均 <0.05)。與陰性對照組比較 ,陽性對照組上述指標(biāo)均增高 (P均 <0.05)。與陽性對照組比較,各實驗組上述指標(biāo)均降低,且隨 IM濃度的升高而降低 (P均 <0.05)。結(jié)論: IM可抑制游離 SiO2粉塵誘導(dǎo)大鼠LF的激活。

游離二氧化硅 (SiO2)粉塵作用于肺泡巨噬細(xì)胞(alveolusmacrophage,AM)將直接或間接導(dǎo)致后者分泌大量炎性細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、轉(zhuǎn) 化 生 長因 子 -β (transforming growth factor,TGF-β)等 ,這些因子可促使培養(yǎng)條件下的人肺成纖維細(xì)胞 (lung fibroblast,LF)增生,膠原蛋白生成增加[1]。甲磺酸伊馬替尼 (imatinib mesylate, IM)屬于血小板生長衍生因子酪氨酸受體抑制劑 (PDGF RTKI)的一種。有研究[2-3]表明IM能夠有效減緩放射引起的小鼠肺纖維化病程。作者用游離 SiO2粉塵刺激的大鼠 AM培養(yǎng)上清誘導(dǎo)LF,觀察誘導(dǎo)的 LF存活情況,α-平滑肌肌動蛋白 (αs mooth muscle actin,α-S MA)、Ⅰ型膠原 (collagenⅠ,COLⅠ)和Ⅲ型膠原 (collagenⅢ,COLⅢ)mRNA的表達(dá)情況,COLⅠ、COLⅢ蛋白及總蛋白的分泌,并觀察 IM應(yīng)用后上述指標(biāo)的變化,探討 IM對體外LF激活過程的影響,為進(jìn)一步的體內(nèi)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

以 GAPDH為內(nèi)參,進(jìn)行 PCR,引物序列及擴增產(chǎn)物大小見表1。PCR反應(yīng)體系:Taq PCR Mix 15.0μL,10μmol/L上下游引物各 0.8μL,SYBR GreenⅠ0.7μL,cDNA模板 1.0μL,滅菌三蒸水 11.7μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃5min;變性 95℃30 s,退火54℃45 s(GAPDH)或退火 61℃45 s(α-S MA、COLⅠ和 COL Ⅲ),延伸 72℃1min,循環(huán)次數(shù) 40;終延伸 72 ℃5min。

1.1 材料 選用河南省實驗動物中心 SPF級成年SD大鼠,體質(zhì)量 150 g。中國疾病預(yù)防控制中心勞動衛(wèi)生研究所研制的結(jié)晶型 SiO2粉塵標(biāo)準(zhǔn)品,其中游離 SiO2含量為 99.8%,粒徑小于 5μm的占 95%以上。 IM購自武漢銀河醫(yī)藥有限公司,純度為99%。優(yōu)級胎牛血清 (FBS)購自杭州四季青生物科技有限公司,DMEM培養(yǎng)基購自 Gibco公司。第一鏈 cDNA合成試劑盒購自天根生化科技有限公司。大鼠 COLⅢ酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海前塵生物有限公司;大鼠 COLⅠ酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國 R&D公司。SYBR GreenⅠ購自廈門百維信生物科技有限公司。

1.2 游離 S iO2粉塵工作液的配制 粉塵經(jīng)研磨恒重干燥,干熱滅菌 (180℃1 h)后,用無血清的DMEM培養(yǎng)基配成 100 mg/L的游離 S iO2粉塵混懸液,漩渦振蕩器上振蕩混勻,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AM、LF的提取純化和 LF的同步化 取 SD大鼠,參照姜明等[4]的方法進(jìn)行LF和AM的提取和純化。取第 5～10代 LF細(xì)胞進(jìn)行試驗。取 LF,經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液,隨機接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),1×106個/60 cm2,以含體積分?jǐn)?shù) 10%FBS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 d后換液,用無 FBS培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h,使LF同步化。

1.4 實驗分組 用游離 SiO2粉塵工作液 (100 mg/L)對離體原代培養(yǎng)的 AM染毒 24 h,離心收集培養(yǎng)上清。陽性對照組用培養(yǎng)上清刺激同步化后的LF;實驗組在培養(yǎng)上清中加入 IM至終濃度為 0.2、1.0和 5.0μmol/L,刺激 LF;陰性對照組用未經(jīng) SiO2刺激的 AM上清培養(yǎng)LF。24 h后收集培養(yǎng)上清。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 細(xì)胞存活情況 使用MTT法檢測上述 5組細(xì)胞存活情況,計算存活細(xì)胞比例。

1.5.2 α-S MA、COLⅠ和 COLⅢmRNA檢測 采用real time-PCR檢測。用 Trizol法提取 LF的總 RNA,紫外分光光度計測定 260 nm和 280 nm處的吸光度(A),A(260 nm)/A(280 nm)的值介于 1.8～2.0。

表1 擴增基因引物序列及產(chǎn)物大小

1.5.3 COLⅠ、COLⅢ及總蛋白測定 采用雙抗體夾心 ABC-酶聯(lián)免疫吸附法測定 COLⅠ、COLⅢ,按試劑盒說明書進(jìn)行。采用 BradFord法測定培養(yǎng)上清中的總蛋白。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。5組間 LF存活細(xì)胞比例,α-S MA、COLⅠ、COL ⅢmRNA及COLⅠ、COLⅢ和總蛋白表達(dá)水平的比較應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5組 LF存活細(xì)胞比例和α-SMA mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果 見表2。

表2 5組 LF存活細(xì)胞比例和α-SMA mRNA表達(dá)水平的比較 (n=3)

2.2 COLⅠ、COLⅢmRNA及蛋白和總蛋白測定結(jié)果 見表3。

表3 5組間 COLⅠ、COLⅢmRNA及蛋白和總蛋白表達(dá)水平的比較 (n=3)

3 討論

矽肺是長期吸入含有結(jié)晶型游離 SiO2粉塵 (矽塵)所引起的以肺組織纖維性病變?yōu)橹鞯娜硇约膊?。矽肺纖維化的發(fā)生,最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是成纖維細(xì)胞的增殖與膠原的沉積。SiO2可刺激AM分泌大量細(xì)胞因子促使 LF活化和增殖,后者將分泌包括膠原蛋白在內(nèi)的大量細(xì)胞外基質(zhì)[5]。矽肺患者 AM培養(yǎng)上清可促進(jìn) LF的增殖,同時也促進(jìn)膠原的合成與分泌[6]。因此抑制 LF的激活和增殖,降低其膠原蛋白分泌水平,將可以有效防治肺纖維化。

作者的研究結(jié)果顯示,陽性對照組 LF存活細(xì)胞比例及α-S MA mRNA表達(dá)水平,COLⅠ、COLⅢmRNA及蛋白和總蛋白表達(dá)水平顯著高于陰性對照組,這與 Vuorinen等[7]關(guān)于青石棉誘發(fā)進(jìn)行性肺纖維化的研究結(jié)果類似;而實驗組隨著 IM濃度的升高,上述指標(biāo)逐漸降低。α-S MA是 LF被激活的生物標(biāo)識,α-S MA的表達(dá)受抑,提示 IM對 SiO2粉塵引起的LF的激活效應(yīng)有一定的抑制作用。COLⅠ及COLⅢ和總蛋白分泌水平降低則表明, IM可抑制SiO2粉塵誘導(dǎo)的LF膠原的合成與分泌。

IM可能通過第二信使途徑[8-9]抑制 LF的蛋白分泌。Azuma等[10]報道 IM能夠顯著抑制至少三種激酶 ,Bcr/Abl,c-Kit和 PDGFR-α、-β,它們都參與纖維化的形成,尤其是與 TGF-β通路交聯(lián)。PDGF信號傳導(dǎo)通路在肺纖維化中起促進(jìn)作用,并且通過抑制該通路治療纖維化疾病的療效已經(jīng)在許多試驗[11-13]中被證實,如特發(fā)性肺纖維化、石棉致纖維化、博萊霉素致肺纖維化、放射致纖維化以及其他器官纖維化如腎、肝、皮膚和心臟等纖維化疾病。因此, IM可能通過 PDGF信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮抑制 LF激活的作用。

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(2010-01-11收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of imatinib mesylate on rat lung fibroblast activation induced by free silica dustin vitro

SHAO M iaom iao,WANG W ei,YAO W u,ZHANG Guanghui,HAO Changfu
Departm ent of Occupational Health,College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

imatinib mesylate;silica;lung fibroblast;collagenⅠ;collagenⅢ;rat

A im:To evaluate the effect of imatinib mesylate( IM)on the activation process of rat lung fibroblast(LF)exposed to free silica(SiO2)dust.Methods:S iO2suspension was used to stimulate alveolusmacrophage for 24 h,and the supernatantwas collected to culture LF(positive control group).In the experimental groups,LF was stimulated by the collected supernatantwith 0.2,1.0,and 5.0μmol/L dose of IM.AM supernatantwithout SiO2was used as negative control.24 h later,the supernatants of all groupswere collected to detect the survival condition of actived LF byMTTmethod,the mRNA expression ofα-S MA,COLⅠ and COLⅢ,using real-time PCR,the COLⅠ and COLⅢprotein by EL ISA,and the total protein byBradFord assay.Results:There were significant differences in the survival condition of IF,the expressions ofα-S MA mRNA,COLⅠmRNA and protein,COLⅢmRNA and protein,and the total protein among the 5 groups(F=3.571,3.904,18.686,6.582,28.983,8.555 and 9.918,P<0.05).Compared with those of the negative control group,the indexeswere higher in positive control group(P<0.05).Comparedwith those of the positive control group,the indexes were lower in the experimental groups,which decreasedwith the IM concentration increase(P<0.05).Conclus ion: IM has the inhibition effect on LF activation stimulated by free SiO2.

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