“三系”不育系微效恢復(fù)基因表現(xiàn)型研究

富昊偉,李友發(fā),馬興華,舒慶堯

(1嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 ,浙江嘉興 314016;2浙江大學(xué)核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,杭州 310029)

中國(guó)完成雜交水稻不育系、保持系和恢復(fù)系的“三系”配套,迄今已逾 30年?！叭怠辈挥祷謴?fù)性的遺傳研究20世紀(jì)80年代中期已基本完成,主要是以單株或主穗的結(jié)實(shí)率為恢復(fù)基因表現(xiàn)型的考查指標(biāo),多數(shù)研究認(rèn)為對(duì)野敗胞質(zhì)不育的主效恢復(fù)效應(yīng)由 2對(duì)主基因控制[1～4],這對(duì)恢復(fù)系的育種實(shí)踐起到了很好的指導(dǎo)作用。

“三系”不育系有一個(gè)普遍的現(xiàn)象:大量的保持系材料,最后轉(zhuǎn)育成的“不育系”,常常因育性不穩(wěn)定而不能成為有實(shí)用價(jià)值的不育系。即使生產(chǎn)上應(yīng)用較廣的不育系如Ⅱ -32A、龍?zhí)仄?A等,也出現(xiàn)了這種因育性不穩(wěn)定而導(dǎo)致的自交結(jié)實(shí)現(xiàn)象[5]。對(duì)這種現(xiàn)象的研究相對(duì)很少。雷捷成等在分析該類型保持系轉(zhuǎn)育不育系的測(cè)交 F1的花粉育性后,提出存在隱性的恢復(fù)基因,后來(lái)又進(jìn)一步修正為微效恢復(fù)基因,即 r基因[6,7]。其后游年順等進(jìn)一步認(rèn)為,微效恢復(fù)基因的表現(xiàn)型是轉(zhuǎn)不育系雜交 F1的花粉黑染現(xiàn)象,并提出黑染率 0.1%～10%是含微效恢復(fù)基因品種的表現(xiàn);同時(shí)還觀察到轉(zhuǎn)育不育系各世代的植株中經(jīng)常出現(xiàn)“嵌合體”現(xiàn)象,即一朵穎花的 6個(gè)花藥中,有1～2個(gè)可育花藥,推測(cè)微效恢復(fù)基因受隱性多基因控制[8,9]。上述研究對(duì)微效恢復(fù)基因表現(xiàn)型及遺傳特性認(rèn)識(shí)提供了有用信息。

本研究旨在通過(guò)對(duì)一些典型保持系材料在轉(zhuǎn)育“三系”不育系時(shí)各世代的育性觀察,探討微效恢復(fù)基因的 3種典型表現(xiàn)型特性,并探尋類似主效恢復(fù)基因遺傳研究中結(jié)實(shí)率這樣的量化指標(biāo),以為進(jìn)一步研究微效恢復(fù)基因的遺傳及分子標(biāo)記等打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

4組“三系”不育系和保持系應(yīng)用于本研究,分別為紫興05A,紫興05B;協(xié)青早 A,協(xié)青早B;黃玉 A,黃玉B;嘉浙 A,嘉浙 B。協(xié)青早A系商業(yè)應(yīng)用20多年的不育系,應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)常有育性波動(dòng),認(rèn)為含微效恢復(fù)基因。本研究應(yīng)用的各世代種子系引進(jìn)保持系后采用人工成對(duì)回交的方法獲得。嘉浙A,紫興05A,黃玉A系浙江大學(xué)或浙江嘉興農(nóng)科院選育,分別在 2000,2004,2005年通過(guò)浙江省技術(shù)鑒定[10～12]。在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)嘉浙 A,黃玉A有不同程度的自交結(jié)實(shí),暗示含微效恢復(fù)基因,而紫興05A的不育性在生產(chǎn)上表現(xiàn)徹底敗育,研究前推測(cè)它不含微效恢復(fù)基因。

2005年春季在海南陵水、2005年夏季在浙江嘉興、2005年秋季在浙江嘉興、2006年春季在海南分別配置了紫興05A、協(xié)青早 A、黃玉 A、嘉浙 A與相應(yīng)保持系的高世代轉(zhuǎn)不育材料 BC8,BC9,BC10代種子(表 1)。需要說(shuō)明的:一是協(xié)青早A系多年前引進(jìn),其轉(zhuǎn)育確切世代已無(wú)從查考,但肯定在 BC20以上,在表 1中參照紫興 05A等 3個(gè)材料的 BC8～BC10記錄;二是后 3組材料中 BC2代種子的獲得,在 BC1群體母本選株時(shí)均根據(jù)育種者的經(jīng)驗(yàn),盡可能選擇和輪回親本相似的單株和輪回親本雜交。

表1 4組不育系和保持系材料及各世代種子的配置

各組材料上一世代的種子均大半保留在冰箱,僅部分用于下一世代種子的繁殖。例如:紫興 05A/紫興05B是 2005年春季在海南收獲 20 g左右 F1代種子,其中 15 g貯存在 4℃冰箱,其余 5 g左右用于對(duì) BC1代種子的繁殖。下一世代種子的獲得均同此法。

1.2 方法

2007年夏季,表 1中的所有材料均種植在浙江省嘉興市農(nóng)科院試驗(yàn)區(qū)。每份材料均在30株以上,4月15日播種,5月12日移栽。田間管理注意肥水平衡,不缺肥不徒長(zhǎng),始穗期田間有淺水。

考查了不育系育性表現(xiàn)的 3種表現(xiàn)型,分別為自交套袋結(jié)實(shí)率、嵌合穎花率、黑染花粉率。具體的考查取樣及方法如下。

1.2.1 自交套袋

每份材料各種植30株。由于黃玉A、B的生育期較長(zhǎng),為了使其與其它各組材料基本在同一時(shí)段抽穗,黃玉 A/黃玉B及紫興05A/紫興05B二組材料4月 5日播種。其余5組材料4月30日播種。適時(shí)移栽,田間采用該季水稻常規(guī)肥水管理方法。抽穗階段逐日觀察植株的抽穗開花情況,每株植株的主穗抽出而尚未開花時(shí)(一般抽出 3～5 cm),用 7 cm×35cm的牛皮紙袋將穗套袋以隔斷外來(lái)花粉。在主穗套袋后 7 d,每株再套袋一個(gè)剛抽出未開花的遲分蘗穗(落腳穗)。均在套袋后20 d考查套袋自交結(jié)實(shí)率。

1.2.2 嵌合穎花率

上述材料每株植株均在抽穗階段選擇次于主穗的第二分蘗穗及7 d后的1個(gè)小分蘗穗。將該穗的每一朵穎花的6顆花藥均剝出來(lái)觀察花藥的顏色分離情況。6顆穎花全部為典型不育系瘦小乳白色花藥的為不育穎花;有1～6粒(含1粒)黃色飽滿花藥的,該朵穎花記為嵌合穎花。嵌合穎花占全部穎花的百分比,記為嵌合穎花率。

1.2.3 花粉育性

(1)隨機(jī)取樣的花粉育性。在上述觀察嵌合穎花率的取樣穗中,隨機(jī)在穗的上、中、下部各取 2朵穎花,每朵穎花隨機(jī)取 2～3個(gè)花藥混合后置于玻片上,加0.1%的 I2-IK溶液,用鑷子夾碎擠出花藥中的花粉。置于4×10倍的顯微鏡下觀察3個(gè)有代表性的視野,統(tǒng)計(jì)黑染花粉(即染敗和正?；ǚ壑?下同)的比例。

(2)選擇性取樣花藥的花粉育性。分別取在上述觀察中的兩類花粉觀察:一類為瘦小乳白色花藥,另一類為飽滿黃色的花藥。各挑取這樣的花藥5個(gè),混合置玻片上,加0.1%的I2-IK染色后,40倍顯微鏡下觀察3個(gè)有代表性的視野,統(tǒng)計(jì)黑染花粉的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 不育系表現(xiàn)不同程度的可育性

4個(gè)高代不育系紫興 05A、協(xié)青早 A、黃玉 A、嘉浙A在3個(gè)世代的套袋自交結(jié)實(shí)率、嵌合穎花率、黑染花粉率的考查結(jié)果見表2。

(1)紫興 05A/紫興 05B。 BC8,BC9,BC10套袋自交結(jié)實(shí)率、嵌合穎花率主穗、遲分蘗穗均為0。該材料因沒有嵌合花藥,花粉育性檢測(cè)均是隨機(jī)取樣,主穗的黑染花粉率均為0;僅在遲分蘗穗的鏡檢花粉中發(fā)現(xiàn)極少量染敗花粉,各世代的黑染花粉率分別為 0.021%,0.014%和 0.018%,這和筆者選用該材料前歷次觀察試驗(yàn)(數(shù)據(jù)未給出)一致。

(2)協(xié)青早 A/協(xié)青早 B。 BC8,BC9,BC10主穗的套袋自交率介于 0.86%～1.12%,遲分蘗穗的套袋自交結(jié)實(shí)率介于 2.16%～2.97%;嵌合穎花率主穗介于10.30%～11.32%,遲分蘗穗介于16.88%～17.32%;隨機(jī)取樣的主穗黑染花粉率在 0.27%～0.36%,遲分蘗穗在 0.17%～0.21%;分類取樣中專門選擇嵌合穎花中飽滿黃花藥檢測(cè)的主穗黑染花粉率為 4.85%～5.21%,遲分蘗穗為6.09%～6.48%。

(3)黃玉 A/黃玉B。3個(gè)世代的主穗和遲分蘗穗的套袋自交結(jié)實(shí)率分別介于1.59%～2.00%和2.16%～2.97%;嵌合穎花率分別介于 22.59%～23.40%和30.09%～30.34%;隨機(jī)取樣的黑染花粉率則分別介于0.22%～0.37%和0.59%～0.83%。

(4)嘉浙 A/嘉浙 B。各世代的主穗和遲分蘗穗的套袋自交結(jié)實(shí)率分別介于1.47%～1.54%和2.89%～3.19%;嵌合穎花率分別介于 38.69%～40.83%和53.62%～57.35%;隨機(jī)取樣的黑染花粉率分別介于1.09%～1.42%和 2.61%～3.58%;飽滿黃花藥檢測(cè)的黑染花粉率分別為 15.98%～16.28%和 19.23%～21.44%。

表2 微效恢復(fù)基因各表現(xiàn)型在4個(gè)高代不育系中的表現(xiàn)

對(duì)上述 4組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,有如下發(fā)現(xiàn):(1)紫興05B各轉(zhuǎn)育世代檢測(cè)的各項(xiàng)指標(biāo)均為 0或趨向 0,因此認(rèn)為紫興05B不含微效恢復(fù)基因。而協(xié)青早B、黃玉B、嘉浙 B均有不同程度的套袋自交結(jié)實(shí)率、嵌合穎花率和黑染花粉率,且同一材料的這 3項(xiàng)指標(biāo)世代間表現(xiàn)穩(wěn)定,沒有顯著差異,由此推斷它們是含有微效恢復(fù)基因的保持系。(2)協(xié)青早 A、黃玉 A、嘉浙 A在套袋自交結(jié)實(shí)率和隨機(jī)取樣的花粉黑染率上無(wú)明顯差異,暗示套袋自交結(jié)實(shí)率和隨機(jī)取樣的黑染花粉率不能有效區(qū)分這3個(gè)材料微效恢復(fù)基因表達(dá)的不同。但在分類黃花藥取樣的黑染花粉率和嵌合穎花率兩個(gè)指標(biāo)上,三者之間存在顯著差異,可以有效區(qū)分三者的不同。(3)無(wú)論主穗或是遲分蘗穗,3項(xiàng)表現(xiàn)型指標(biāo)在3個(gè)材料中表現(xiàn)的共同特點(diǎn)是,嵌合穎花率>分類取樣中飽滿黃花藥的黑染花粉率>套袋自交率>隨機(jī)取樣的黑染花粉率。(4)嵌合穎花率的數(shù)值和套袋自交率或隨機(jī)取樣的黑染花粉率相比,存在10倍以上的數(shù)量級(jí)差異。以3個(gè)轉(zhuǎn)不育世代主穗平均值作比較,協(xié)青早 B的套袋自交結(jié)實(shí)率、黑染花粉率和嵌合穎花率分別為 1.01%,10.90%,0.33%;黃玉 B的分別為 1.77%,23.10%,0.31%;嘉浙 B的分別為1.50%,39.88%,1.23%。

2.2 不同表現(xiàn)型的可量化特點(diǎn)

套袋自交結(jié)實(shí)率是考查最方便的,也是主效恢復(fù)基因研究中應(yīng)用最多的育性考查指標(biāo),很自然地會(huì)推測(cè)其能否作為微效恢復(fù)基因的可量化指標(biāo)。從表2可以看出,套袋自交結(jié)實(shí)率作為不育系育性的表現(xiàn)型,有兩個(gè)特點(diǎn):一是結(jié)實(shí)率的絕對(duì)值很小,在 10-2數(shù)量級(jí),其二是標(biāo)準(zhǔn)差較大。以BC8代為例,協(xié)青早 A,黃玉 A,嘉浙 A的主穗套袋自交結(jié)實(shí)率分別為 0.86±0.55%,2.00± 0.73%,1.47± 1.31%,遲分蘗穗分別為 2.89±1.32%,2.97± 1.68%,3.13± 1.62% 。 BC9,BC10世代的數(shù)據(jù)也有相同趨勢(shì)。此外,考種實(shí)踐也證實(shí),該數(shù)量級(jí)的自交結(jié)實(shí)率,絕大部分套袋稻穗的結(jié)實(shí)谷粒在0～3粒之間,其表達(dá)的結(jié)實(shí)率變化的范圍相當(dāng)狹窄。此外,即使在嵌合穎花率達(dá)到40.83%的嘉浙A的BC8的30個(gè)套袋自交穗中,仍有 3個(gè)穗的自交結(jié)實(shí)率為 0,占觀察數(shù)據(jù)的10%。協(xié)青早A的BC8套袋自交結(jié)實(shí)率為0的有7個(gè),占23.3%(數(shù)據(jù)未列出)。由此可以認(rèn)為,群體的平均套袋自交結(jié)實(shí)率雖然一定程度上定性反映了微效恢復(fù)基因的表現(xiàn),但在需要考查單個(gè)植株的表現(xiàn)型(這在遺傳研究分離群體時(shí)是必需的),套袋自交結(jié)實(shí)率會(huì)出現(xiàn)根本性的偏差,因此不能作為微效恢復(fù)基因遺傳研究的可量化指標(biāo)。

隨機(jī)取樣的黑染花粉率,與套袋自交結(jié)實(shí)率的數(shù)據(jù)具有相似之處,即絕對(duì)數(shù)值較小,而標(biāo)準(zhǔn)差較大。同樣以協(xié)青早 A、黃玉 A、嘉浙 A的 BC8代主穗的隨機(jī)取樣黑染花粉率為例,3組觀察值分別為0.36±0.77%,0.33±0.60%,1.17±1.00%。其它各世代也有類似的趨勢(shì),因此也不宜作為微效恢復(fù)基因遺傳研究的可量化指標(biāo)。

但是,分類取樣中專取飽滿黃花藥觀察的黑染花粉率表現(xiàn)不同,協(xié)青早 A,黃玉 A,嘉浙 A的BC8代主穗的分類取樣黑染花粉率分別為5.01±1.05%,10.56±1.46%,16.19±2.09%,數(shù)據(jù)的絕對(duì)值較隨機(jī)取樣的黑染花粉率有數(shù)量級(jí)的增加,標(biāo)準(zhǔn)差也相對(duì)減小,其遲分蘗穗的觀察數(shù)據(jù)也是相同的趨勢(shì),分別為 6.13±1.29%,12.15± 1.42%,9.96± 2.28%(表 2)。可見 ,專取黃花藥觀察的黑染花粉率已初步具備作為可量化指標(biāo)的特點(diǎn)。其缺陷可能在于實(shí)際操作中如果大樣本觀察,以水稻的單穗為100粒計(jì),對(duì)一個(gè)穗所有穎花中的飽滿黃花藥進(jìn)行花粉鏡檢,工作量就比較大,更不用說(shuō)一個(gè)群體中的所有穗的穎花鏡檢的工作量了。

嵌合穎花現(xiàn)象是可比較簡(jiǎn)便地觀察的表現(xiàn)型。只需剝開穎殼,則不育系中黃花藥(通常較肥大)和水漬狀的乳白花藥是能直觀區(qū)分的。其次,在4個(gè)不同材料之間,嵌合穎花率有明顯層次差異。以BC8～BC103個(gè)世代的平均值為例,紫興05A主穗和遲分蘗穗均為0;協(xié)青早 A分別為 10.90%和 17.09%;黃玉 A分別為23.10%和30.23%;嘉浙 A分別為 39.88%和55.01%(表 2)。彼此之間差異均達(dá)顯著水平,說(shuō)明嵌合穎花率能有效區(qū)分不同類型材料微效恢復(fù)基因的表現(xiàn)。再次,嵌合穎花率的數(shù)據(jù)絕對(duì)值也是 3個(gè)指標(biāo)中最大的,且標(biāo)準(zhǔn)差較小,具有穩(wěn)定性。更重要的是,由于一朵穎花有6個(gè)花藥,而嵌合穎花定義為只要有1個(gè)以上花藥為飽滿黃花藥即為嵌合穎花,實(shí)際操作中可以避免如花粉鏡檢時(shí)取樣的誤差,實(shí)現(xiàn)全樣本檢測(cè),避免取樣誤差。還有一點(diǎn),從對(duì)嵌合穎花中飽滿黃花藥和瘦小乳白花藥的分類花粉育性觀察中發(fā)現(xiàn),瘦小乳白花藥中不含黑染花粉,黑染花粉完全來(lái)自飽滿黃花藥(表2)。這就進(jìn)一步說(shuō)明嵌合穎花中的黃花藥確是微效恢復(fù)基因的表現(xiàn)型載體。

綜上所述,我們認(rèn)為嵌合穎花率具備了作為微效恢復(fù)基因研究中可量化指標(biāo)的條件,是最合適的可量化指標(biāo)。

3 討 論

從生物學(xué)角度看,套袋自交結(jié)實(shí)率的影響因素包含了花粉發(fā)育、開花、受精及其環(huán)境影響的生理、生態(tài)等諸多因素,并不是恢復(fù)性的真實(shí)反映。而花粉育性反映的是花粉不育性的遺傳特性,應(yīng)是研究恢復(fù)性的關(guān)鍵數(shù)據(jù)。本研究證實(shí)可作微效恢復(fù)基因表現(xiàn)型量化指標(biāo)的嵌合穎花,在某種程度是介于上述兩個(gè)指標(biāo)之間的一個(gè)指標(biāo)。它是黑染花粉的載體,是微效恢復(fù)基因花粉育性的體現(xiàn),但又可以穎花為單位進(jìn)行考查,具有操作上的簡(jiǎn)便性。雖然嵌合穎花這種表現(xiàn)型并不是本研究首次提出,如游年順等提出的“嵌合花粉囊”[9],與“嵌合穎花”是同一個(gè)概念,但他們未曾就該指標(biāo)是否可用于量化進(jìn)行分析,更未曾應(yīng)用該指標(biāo)對(duì)微效恢復(fù)基因的遺傳規(guī)律進(jìn)行研究,因此該量化指標(biāo)的重新提出,對(duì)微效恢復(fù)基因的遺傳研究是一個(gè)有力的推進(jìn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)嵌合穎花率在主穗和遲分蘗穗之間有一定差異,一般表現(xiàn)為遲分蘗穗的嵌合穎花率較主穗為高,這可能和主穗和遲分蘗穗花粉發(fā)育時(shí)期不同的環(huán)境有關(guān)。

此外,我們應(yīng)用嵌合穎花率這個(gè)指標(biāo)對(duì)嘉浙 B的微效恢復(fù)基因的遺傳進(jìn)行的研究已初步完成,結(jié)果將后續(xù)報(bào)道。

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