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    應(yīng)用分子標(biāo)記探討多胚亞麻的分類地位

    2010-12-05 07:00:12康慶華黃文功姜衛(wèi)東趙東升宋喜霞孫中義吳廣文關(guān)鳳芝
    中國(guó)麻業(yè)科學(xué) 2010年2期
    關(guān)鍵詞:亞麻種質(zhì)多態(tài)性

    康慶華 ,黃文功 ,劉 巖 ,姜衛(wèi)東 ,趙東升 ,宋喜霞 ,孫中義 ,吳廣文 ,關(guān)鳳芝

    (1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,哈爾濱150086;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究中心,哈爾濱 150086)

    多胚亞麻品系1-6Ha-3是從俄羅斯引進(jìn)的多胚種質(zhì)D95029(形態(tài)特征接近油用亞麻)與纖維亞麻抗6的雜交后代中多胚種子產(chǎn)生的單倍體苗加倍后獲得的雙單倍體(DH)品系。該品系形態(tài)特征明顯區(qū)別于油用亞麻,更接近纖維亞麻,而且株高、工藝長(zhǎng)等農(nóng)藝性狀都優(yōu)于親本。經(jīng)兩年的所內(nèi)鑒定,其原莖產(chǎn)量、纖維產(chǎn)量、全麻率都高于對(duì)照品種黑亞11號(hào)和黑亞14號(hào),同時(shí)具有高頻率的多胚特性。為直接用于生產(chǎn)或作為優(yōu)良育種親本更好的利用,明確其在栽培亞麻品種中的地位及與各品種間的遺傳差異非常必要。

    目前,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多成功應(yīng)用RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)技術(shù)和SSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù),又稱微衛(wèi)星標(biāo)記)等分子標(biāo)記技術(shù)探討物種的分類及親緣關(guān)系的研究報(bào)道[1-8]。隨后,基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來(lái)的ISSR(inter-simple sequence repeat,即簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性)技術(shù),因其具有重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn),也被廣泛用于作物遺傳多樣性研究、種質(zhì)資源的分類和鑒定、重要農(nóng)藝基因的定位與遺傳作圖上[9-10]。本研究以RAPD技術(shù)和ISSR技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)所獲得的多胚DH品系1-6Ha-3與其他23個(gè)亞麻品種的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析,旨在為多胚亞麻品種的鑒定、保護(hù)和分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。同時(shí)也為篩選亞麻多胚性分子標(biāo)記的研究工作奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)于2008年6月至2009年1月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試24個(gè)亞麻品種(系)均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供,見(jiàn)表1。

    表1 供試的24份亞麻材料Table 1 Twentyfour materials ofLinum usitatissmum L.for the experiment

    1.2 方法

    1.2.1 總DNA的提?。簛喡榭侱NA的提取試驗(yàn)參考王關(guān)林、方宏筠的方法[11],取0.2g亞麻幼嫩葉片,加500 μL CTAB(內(nèi)含0.4%巰基乙醇和1%PVP),用液氮研磨,利用購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取試劑盒提取。

    1.2.2 PCR擴(kuò)增體系及程序:按黃文功(2009)的方法[12]進(jìn)行。

    1.2.2.1 引物:供試引物包括RAPD隨機(jī)引物70條:A1~A16,S1~S50,S61~S64;ISSR引物21條,選自丁明忠等(2009)在苧麻分子標(biāo)記中篩選到的U系列引物[13]。以上引物均購(gòu)自上海生工。

    1.2.2.2 PCR 反應(yīng)體系:總體積 25 μL:10×Buffer 2.5 μL,25 mmol/LMgCl21.0 μL,2.5 mmol/LdNTP 2.5μL,primer(25μmol/L)1.5μL,GenomeDNA2μL(50ng),5U/μLTaq酶0.2μL,加ddH2O至總體積25μL。Marker:100bpladder。以上常規(guī)試劑均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

    1.2.2.3 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min;然后94℃變性40 s,37℃退火1 min,72℃延伸90 s,共40個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠,80 V電壓下電泳。EB(溴化乙錠)染色,紫外分析儀上檢測(cè)并照相。

    1.2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì):綜合各引物的擴(kuò)增圖譜,篩選在這24份材料中擴(kuò)增豐富且多態(tài)性好的引物。各擴(kuò)增產(chǎn)物的記錄以所用引物加上其相對(duì)分子量大小表示,每一條帶在某一個(gè)樣品存在賦值“1”,缺乏賦值“0”,強(qiáng)帶和可重復(fù)的弱帶賦值均為“1”。數(shù)據(jù)錄入NTSYSpc2.10e軟件,計(jì)算各個(gè)樣品間的遺傳相似性系數(shù)(GS),對(duì)得到的遺傳相似性矩陣進(jìn)行非加權(quán)組法(UPGMA)聚類分析,建立該多胚亞麻品系與其他供試品種(系)間的親緣關(guān)系圖。根據(jù)遺傳相似系數(shù)計(jì)算出遺傳距離GD(遺傳距離=1-遺傳相似度)[14]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 引物的篩選

    選擇一定數(shù)量的引物對(duì)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增是獲得客觀結(jié)果的前提。本試驗(yàn)在隨機(jī)選擇的70條RAPD引物和21條ISSR引物中篩選出對(duì)供試亞麻材料能擴(kuò)增出清晰的譜帶、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的引物10條,其中RAPD引物5條,ISSR引物5條(見(jiàn)表2)。

    2.2 亞麻DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

    2.2.1 24個(gè)亞麻品種的DNA多態(tài)性

    篩選出的10條引物擴(kuò)增的帶型較理想,多態(tài)性較好,3次重復(fù)擴(kuò)增的結(jié)果一致。這10個(gè)引物共擴(kuò)增出115條帶,其中同源片段28條,多態(tài)性條帶87條,多態(tài)性比例為75.7%。平均每條引物擴(kuò)增出11.5條帶,譜帶大小一般在200~2000bp,也有極少數(shù)在100bp~200bp之間或超過(guò)2000bp。其中擴(kuò)增譜帶最多的引物是U835(15條),擴(kuò)增出的譜帶最少的引物有A5和U853,各為9條。表2為10條引物在24個(gè)亞麻品種中的擴(kuò)增結(jié)果。圖1、圖2和圖3為選用3個(gè)引物A12、A5和U853的基因組DNA的指紋圖譜。

    表2 10條引物的RAPD和ISSR擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Ten primers and their RAPDand ISSR amplification results

    圖1 引物A12在24個(gè)亞麻品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果1-24.亞麻品種編號(hào)(表 1);M.100bp ladderFig.1 PCR amplification results ofthe 24 flaxcultivars usingprimer A121-24:flaxvarieties sample number(table 1);M:100bp ladder

    圖2 引物A5在24個(gè)亞麻品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果1-24.亞麻品種編號(hào)(表 1);M.100bp ladderFig.2 PCR amplification results ofthe 24 flaxcultivars usingprimer A51-24:flaxvarieties sample number(table 1);M.100bp ladder

    圖3 引物U853在24個(gè)亞麻品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果1-24.亞麻品種編號(hào)(表 1);M.100bp ladderFig.3 PCR amplification results ofthe 24 flaxcultivars usingprimer U8531-24:flaxvarieties sample number(table 1);M.100bp ladder

    2.2.2 聚類分析結(jié)果

    根據(jù)10個(gè)引物的擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析,得到24個(gè)亞麻品種(系)的遺傳相似度值(表3)和遺傳聚類樹(shù)狀圖(圖4)。24份亞麻種質(zhì)在閾值(遺傳相似系數(shù))為0.73處分為四大類,V19(黑亞 11 號(hào))、V18(Ariane)、V23(D97009-12)等 21 品種聚為第一大類,1-6Ha-3、黑亞 10 號(hào)、原05-15分別為第二、三、四類群。1-6Ha-3與其他23個(gè)亞麻品種的遺傳相似系數(shù)范圍分布在0.6522~0.7739之間,遺傳距離由大到小為V24/V21/V19>V23>V17>V15/V4>V16>V20>V13>V3>V22>V14>V6>V18>V12>V2>V8>V10>V11>V7>V1/V5。遺傳距離計(jì)算公式得:1-6Ha-3與黑亞 10號(hào)(V24)、原 2006-13(V21)、黑亞 11號(hào)(V19)三個(gè)品種的遺傳距離最遠(yuǎn),都為 0.3478,與品種原 2005-21 白(V5)、98-338(V1)的遺傳距離相對(duì)最近,為 0.2261。

    圖4 24個(gè)亞麻栽培品種的聚類分析Fig.4 Clusteringdiagramfor 24 cultivars ofLinum usitatissmum L.

    3 結(jié)論與討論

    3.1 在應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行植物品種分類及親緣關(guān)系鑒定過(guò)程中,引物的篩選是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,直接影響聚類結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中共篩選出的10個(gè)(5個(gè)RAPD和5個(gè)ISSR)引物擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶多、多態(tài)性豐富。利用這10個(gè)引物對(duì)包括多胚亞麻1-6Ha-3在內(nèi)的24份材料(系)的基因組進(jìn)行擴(kuò)增,得到了115條清晰譜帶,其中87條屬于多態(tài)性標(biāo)記,多態(tài)性位點(diǎn)的比例達(dá)75.7%。該結(jié)果很好地揭示了這24份資源的遺傳多樣性,由此鑒定出各材料間存在著遺傳差異。根據(jù)這10個(gè)引物對(duì)每份材料的擴(kuò)增結(jié)果,將供試的24份亞麻種質(zhì)在閾值(相似系數(shù))為0.73處分為四大類群,多胚品系1-6Ha-3獨(dú)為第二類群,且與其他23個(gè)亞麻品種的遺傳相似系數(shù)分布在0.6522~0.7739之間,說(shuō)明該品系與其他材料間都存在著較大的遺傳差異。并且從分子水平上鑒定出該多胚品系與黑亞10號(hào)(V24)、原 2006-13(V21)、黑亞 11 號(hào)(V19)、原 2005-15(V17)等品種的遺傳距離較大,與原2005-21(V5)、98-338、SXY20等品種的遺傳距離相對(duì)較近。一般地,遺傳距離較遠(yuǎn)或不同類型的材料間雜交時(shí)雜交優(yōu)勢(shì)較高[15]。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果,可在1-6Ha-3和與其遺傳距離遠(yuǎn)的黑亞10號(hào)、原2006-13等品種間配制雜交組合,有可能從其雜交后代的多胚種子中獲得雜交優(yōu)勢(shì)高的單倍體植株,采用化學(xué)加倍或自然加倍方法達(dá)到快速固定雜交優(yōu)勢(shì)的目的。因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為利用多胚亞麻固定雜種優(yōu)勢(shì)的研究提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

    表3 24個(gè)亞麻基因型相似性系數(shù)矩陣Table 3 The genotype similaritymatrixof24 flax

    3.2 本研究通過(guò)RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)認(rèn)定多胚亞麻與其他栽培亞麻品種之間的關(guān)系的分析結(jié)果表明,該方法能較好的用于分析亞麻屬種下樣品的遺傳距離,更能靈敏地揭示兩個(gè)關(guān)系相近的個(gè)體之間的遺傳差異。適合解決種下分類鑒定的問(wèn)題。并能為擴(kuò)大資源利用和研究提供新的線索。

    3.3 由于在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一些品種(系)間雖然植物學(xué)形態(tài)特征存在著較大差異,但分子標(biāo)記結(jié)果相似系數(shù)較高而聚為一類;也有部分品種(系)雖然形態(tài)表現(xiàn)出相似特征,但因分子標(biāo)記結(jié)果相似系數(shù)小卻未聚到一類。這可能是由于品種在長(zhǎng)期種植、選擇或雜交過(guò)程中,使其在地理分布、形態(tài)特征、生態(tài)類型等方面發(fā)生了較大的變異。因此,只有采用形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記及多種分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合的方法,以更多不同基因型種質(zhì)為試驗(yàn)樣本群體,才能更全面準(zhǔn)確的揭示遺傳變異,為新品種選育制訂策略,為親本選配、后代遺傳變異及雜種優(yōu)勢(shì)水平的預(yù)測(cè)提供預(yù)見(jiàn)性指導(dǎo)。為種質(zhì)資源的利用、新品種(系)的選育提供科學(xué)依據(jù)。

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