抗抑郁化合物SIPI5358與環(huán)糊精形成的非共價(jià)復(fù)合物

何小丹 姜 丹 陳 琛 儲(chǔ)艷秋 丁傳凡,*

翁志潔2 李建其2,*

(1復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系激光化學(xué)研究所,上海市分子催化和功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200433; 2上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

抗抑郁化合物SIPI5358與環(huán)糊精形成的非共價(jià)復(fù)合物

何小丹1姜 丹1陳 琛1儲(chǔ)艷秋1丁傳凡1,*

翁志潔2李建其2,*

(1復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系激光化學(xué)研究所,上海市分子催化和功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200433;2上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)和串級(jí)質(zhì)譜(MS/MS),并結(jié)合紫外光譜、熒光光譜等方法,研究一種芳烷醇哌嗪類抗抑郁化合物SIPI5358與α-、β-、γ-環(huán)糊精(CD)制備得到的非共價(jià)復(fù)合物.質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,SIPI5358分子可以和α-CD生成配合比為1∶1的非共價(jià)復(fù)合物,而與β-、γ-CD生成不同配合比的非共價(jià)復(fù)合物.串級(jí)質(zhì)譜的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證β-CD與SIPI5358非共價(jià)復(fù)合物的組成.用紫外光譜和熒光光譜實(shí)驗(yàn)對(duì)液相中非共價(jià)復(fù)合物的形成進(jìn)行了輔助研究,結(jié)果均再次驗(yàn)證了非共價(jià)復(fù)合物的生成.熒光光譜實(shí)驗(yàn)測(cè)得SIPI5358與β-CD反應(yīng)的生成常數(shù)Kf=3.45×103mol·L-1.

環(huán)糊精;抗抑郁;非共價(jià)復(fù)合物;紫外光譜;電噴霧電離質(zhì)譜;熒光光譜

抑郁癥是一種常見的精神科的疾病,易于復(fù)發(fā),需連續(xù)長時(shí)間服藥,目前已成為全球范圍內(nèi)精神科自殺率最高的疾病之一.普遍公認(rèn)的治療抑郁癥藥物包括單胺氧化酶抑制劑(MAOI)和三環(huán)類抗抑郁藥(TCA)在內(nèi)的第一代抗抑郁藥,和以選擇性五羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑為主的第二類抗抑郁藥[1-2].單胺氧化酶抑制劑類藥物曾一度廣為應(yīng)用,不久因引起高血壓等嚴(yán)重副作用而被淘汰;而第二類抑郁藥物大多具有阻斷多種遞質(zhì)受體的效果,可能擾亂多種神經(jīng)傳導(dǎo).因此,高效、低毒、副作用少的新藥成為了研究的焦點(diǎn).SIPI5358是上海醫(yī)藥工業(yè)研究院的李建其課題組根據(jù)藥物作用靶點(diǎn),定向設(shè)計(jì)和合成的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗抑郁活性化合物,屬于芳烷醇哌嗪衍生物[3],是針對(duì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)及多巴胺(DA)再攝取過程定向設(shè)計(jì)合成的分子,已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中達(dá)到了預(yù)期的三重選擇性抑制作用,體現(xiàn)出顯著的抗抑郁活性,其不良反應(yīng)較常規(guī)抗抑郁藥物少,起效更快,是一種很有開發(fā)前景的化合物.然而,由于SIPI5358水溶性較差,目前尚不能達(dá)到臨床應(yīng)用的要求,因此需要尋找新的方法來增加SIPI5358的溶解度.

環(huán)糊精(cyclodextrin,簡稱CD)[4]是由環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉或直鏈環(huán)糊精而形成的一類環(huán)狀低聚糖,它是一種水溶性、非還原性、不易被酸水解、無毒、可食用、具有多孔性的白色晶體.常見的環(huán)糊精有α-CD、β-CD以及γ-CD 3種,它們分別由6-8個(gè)葡萄糖單元以1,4-糖苷鍵結(jié)合而成的[5].由于連接葡萄糖單元的糖苷鍵不能自由旋轉(zhuǎn),環(huán)糊精分子不是直筒狀的圓柱體結(jié)構(gòu),而是呈現(xiàn)兩端直徑不同的圓筒形結(jié)構(gòu),其中環(huán)糊精的伯羥基圍成了圓筒形的小口,而其仲羥基圍成了圓筒形的大口.具有這種特殊結(jié)構(gòu)的環(huán)糊精分子外緣親水而內(nèi)腔疏水,可以作為主體分子(host)包絡(luò)各種適當(dāng)?shù)目腕w分子(guest),如有機(jī)分子等,通過疏水作用、氫鍵和范德華力等與嵌入疏水孔洞的客體分子組合成單分子非共價(jià)復(fù)合物[6-8].前人已經(jīng)成功地用環(huán)糊精和藥物結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物的方法包合了抗腫瘤和抗高血壓等藥物[9-10]來提高藥效.因此,可以嘗試采用制備環(huán)糊精和SIPI5358非共價(jià)復(fù)合物來提高其溶解度.

近年來,非共價(jià)復(fù)合物在醫(yī)藥上得到了廣泛的應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)表明,一些小分子與生物大分子均能生成非共價(jià)復(fù)合物[11-13],許多分析技術(shù)包括紫外-可見分光光度法、熒光光譜、核磁共振光譜[14]等都被用于檢測(cè)非共價(jià)復(fù)合物.質(zhì)譜技術(shù)憑借其高靈敏度、高精度和高速度的優(yōu)勢(shì)[15-18],有效地推動(dòng)了非共價(jià)復(fù)合物的研究[19-23].例如Terrier等[24]在對(duì)該復(fù)合物進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)時(shí),發(fā)現(xiàn)非共價(jià)復(fù)合物的電荷態(tài)和多聚堿性氨基酸的性質(zhì)不同會(huì)導(dǎo)致不同的解離途徑.最近,Liu等[25]用電噴霧質(zhì)譜研究了22個(gè)黃酮類化合物(其中9個(gè)黃酮苷元,13個(gè)黃酮糖苷)與DNA三鏈形成非共價(jià)復(fù)合物,結(jié)果顯示苷元的羥基位置、多糖的數(shù)量和黃酮類苷元的骨架在與DNA三鏈結(jié)合中起至關(guān)重要的作用,而糖苷展示比其相應(yīng)的苷元對(duì)DNA三鏈有更高的鍵合能力.

SIPI5358,SIPI5357[26]和SIPI5838[27]分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是都具有哌嗪母體,兩端分別為苯基和萘基的系列衍生物,它們都具有抗抑郁活性,其中SIPI5838已進(jìn)入臨床前研究階段[1].本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)采用電噴霧質(zhì)譜結(jié)合紫外光譜成功地研究了SIPI5357[26]和SIPI5838[27]與α-、β-CD形成的非共價(jià)復(fù)合物,質(zhì)譜測(cè)量結(jié)果表明,SIPI5357、SIPI5838分子均可以與環(huán)糊精分子生成配合比(1∶1)的非共價(jià)復(fù)合物.這些非共價(jià)復(fù)合物的形成可以顯著地提高該抗抑郁化合物在水溶液中的溶解度.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明藥物水溶解度的提高可以有效地減小該抗抑郁化合物在體內(nèi)的沉積,使得它們具有臨床使用的可能.另外,紫外分光光度法的輔助研究表明非共價(jià)復(fù)合物可以在液相中生成.溶解度實(shí)驗(yàn)計(jì)算了SIPI5357、SIPI5838和兩種環(huán)糊精分子在液相中的生成常數(shù),表明非共價(jià)復(fù)合物的穩(wěn)定程度為β-CD-SIPI5838＞α-CD-SIPI5838,β-CD-SIPI5357＞α-CD-SIPI5357.

前人研究結(jié)果[28]顯示當(dāng)客體分子為塊狀或長鏈化合物時(shí),可能會(huì)形成一分子CD與兩分子客體或一分子客體與兩分子CD相結(jié)合的復(fù)合物,例如雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium,簡稱DS)和β-CD形成的復(fù)合物中,不僅含有配合比1∶1的β-CD-DS產(chǎn)物,還含有配合比1∶2或2∶1的β-CD-DS產(chǎn)物.SIPI5838分子的兩端分別為苯基和萘基,與CD分子相比,具有長鏈化合物的特點(diǎn),具有形成2∶1的β-CDSIPI5838復(fù)合物的潛在可能性.然而,哌嗪類SIPI系列抗抑郁化合物形成的復(fù)合物可能有哪幾種配合比到目前為止還沒有完全明白,這引起了我們的研究興趣.此外,以前的工作主要是針對(duì)哌嗪類抗抑郁化合物和α-、β-CD非共價(jià)復(fù)合物的研究,但尚未涉及γ-CD的研究,而且抗抑郁化合物SIPI5358和β、γ-CD非共價(jià)復(fù)合物的穩(wěn)定性尚不明確.

本文在前面工作[27]的基礎(chǔ)上,將采用電噴霧質(zhì)譜等技術(shù)研究SIPI5358和α-、β-、γ-CD之間的非共價(jià)相互作用,確定有幾種不同配合比的復(fù)合物,用熒光和紫外光譜法證明藥物和環(huán)糊精在液相中的反應(yīng),并用熒光光譜法測(cè)定β-CD和SIPI5358反應(yīng)的生成常數(shù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)試劑

實(shí)驗(yàn)中所用的α-CD(純度98%),β-CD(純度98%),γ-CD(純度99%)購于Sigma化學(xué)試劑公司(St.Louis,MO,USA),分子量分別為∶α-CD,972.86; β-CD,1134.98;γ-CD,1297.15.甲醇(純度99.5%).抗抑郁化合物SIPI5358由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供(純度99%),相對(duì)分子質(zhì)量467.1(不包含2HCl· 2H2O),其結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

1.2 非共價(jià)復(fù)合物的制備

將SIPI5358溶于甲醇中,配成1×10-3mol·L-1的溶液a,將α-、β-、γ-CD分別溶于去離子水中,配成1×10-3mol·L-1的溶液,依次為溶液b、c、d.取1 mL溶液a分別和不同體積的溶液b、c、d混合,均配成5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5摩爾比的混合溶液,所有混合樣品用50%(體積比)的甲醇稀釋至10 mL后搖勻,得到三套不同摩爾比的反應(yīng)液,放入30℃的恒溫箱內(nèi)反應(yīng)24 h.取上述SIPI5358分別與α-、β-、γ-CD混合的三種反應(yīng)液(1∶5)各1 mL進(jìn)行混合,并用50%(體積比)的甲醇稀釋至10 mL可得到混合溶液A.分別取5 mL溶液b、c、d和3 mL溶液a進(jìn)行混合,用50%(體積比)的甲醇稀釋至30 mL即溶液B,將溶液B在30℃恒溫箱內(nèi)反應(yīng)24 h,即可得到SIPI5358同時(shí)與α-、β-、γ-CD反應(yīng)的混合溶液B.

溶液a、b、c、d均用50%(體積比)的甲醇稀釋至1×10-4mol·L-1,作為參比液.所制備的溶液用于電噴霧電離質(zhì)譜、串級(jí)質(zhì)譜、紫外光譜、熒光光譜的測(cè)定.

1.3 電噴霧電離質(zhì)譜的測(cè)定

質(zhì)譜測(cè)定所用的儀器裝置為電噴霧電離-三重四極桿質(zhì)譜儀(API III Plus,PE-Sciex,加拿大,m/z 2400).質(zhì)譜儀的質(zhì)量標(biāo)定選用聚丙二醇(PPG)標(biāo)準(zhǔn)樣品.所用的助噴霧氣和簾氣均為高純氮?dú)?99.999%).以1.2 μL·min-1的進(jìn)樣速度進(jìn)行電噴霧電離產(chǎn)生樣品離子.

1.4 串級(jí)質(zhì)譜分析

為了探討SIPI5358溶液和環(huán)糊精所生成的非共價(jià)復(fù)合物結(jié)構(gòu),我們還對(duì)質(zhì)譜測(cè)量中所得到的非共價(jià)復(fù)合物離子進(jìn)行了串級(jí)質(zhì)譜分析,測(cè)量了此非共價(jià)復(fù)合物離子的碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)物,所用的碰撞氣體為高純氬氣.碰撞能量數(shù)值由四級(jí)桿Q0和碰撞池Q2的電壓差[n(R0-R2)]計(jì)算而得,其中n為母離子電荷數(shù),R0和R2分別為離子導(dǎo)引四極桿Q0和碰撞池Q2上的直流電壓.

1.5 紫外光譜的測(cè)定

紫外-可見分光光度計(jì)(Agilent8453,Agilent公司,美國).紫外光譜在室溫下測(cè)得,樣品的光譜掃描范圍190-260 nm.

1.6 熒光光譜的測(cè)定

熒光分光光度計(jì)(Cary Eclipse,Varian公司,美國).熒光光譜波長范圍∶激發(fā)態(tài)200-900 nm.將熒光分光光度計(jì)設(shè)置為激發(fā)光柵和發(fā)射光柵都是5 nm,電壓600 V,激發(fā)波長為280 nm,掃描速率600 nm·min-1.然后各取1.5 mL溶液a和溶液c放入石英比色皿中,立即放入熒光光度計(jì)中從開始掃描熒光發(fā)射譜圖.從300 nm掃到500 nm,起初每間隔1 min掃描一次,直到熒光強(qiáng)度變化不大時(shí)開始擴(kuò)大間隔.

1.6.2 用熒光光度計(jì)測(cè)定SIPI5358與β-CD的生成常數(shù)

每次取1 mL溶液a,依次與1、2、3、4、5、6、7、8 mL溶液c分別混合,共8組溶液,用50%(體積比)的甲醇溶液稀釋到10 mL,重復(fù)3次.將上述混合液在30℃恒溫箱中放置24 h.熒光光度計(jì)掃描設(shè)定及掃描范圍同上.

2 結(jié)果與討論

2.1 α-、β-、γ-CD和SIPI5358的質(zhì)譜測(cè)量結(jié)果

α-、β-、γ-CD和SIPI5358在電噴霧電離質(zhì)譜圖中均以帶一分子水的單電荷離子存在,即[α-CD+ H3O]+、[β-CD+H3O]+、[γ-CD+H3O]+和[SIPI5358+H]+.它們的質(zhì)譜峰m/z分別出現(xiàn)在991.0、1153.1、1315.2和467.8處.

2.2 α-、β-、γ-CD和SIPI5358的非共價(jià)復(fù)合物

質(zhì)譜測(cè)量結(jié)果

選取我院2016年6月～2018年6月收治的624例危重疾病患者，回顧分析其臨床資料：①男377例，女247例；②年齡16～92歲，平均（59.25±12.34）歲。

α-CD與SIPI5358以5∶1混合反應(yīng)后得到的質(zhì)譜圖如圖2所示,m/z=1440.5所對(duì)應(yīng)的分子離子為[α-CD+SIPI5358+H]+離子,它表明,α-CD與SIPI5358之間有新的復(fù)合物生成.前人[28]曾經(jīng)報(bào)道環(huán)糊精分子是含有較多羥基的低聚糖化合物,故SIPI5358客體分子和環(huán)糊精主體分子之間的結(jié)合力主要可能為氫鍵和疏水力.

β-CD和SIPI5358以5∶1混合反應(yīng)后得到的質(zhì)譜圖如圖3所示,形成的非共價(jià)復(fù)合物以及兩者的配合比均能夠從ESI質(zhì)譜圖上得出.值得注意的是, β-CD與SIPI5358混合反應(yīng)后得到的質(zhì)譜圖(圖3a)中除了生成兩者配合比為1∶1的復(fù)合物之外,還有配合比為1∶2、2∶1兩種形式存在.圖3a中的三個(gè)離子的放大圖分別列于圖3(b,c,d),其中m/z=1035.5所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰為[β-CD+2SIPI5358+2H]2+離子(見圖3b),m/z=1377.8所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰為[2β-CD+ SIPI5358+H2O+2H]2+離子(見圖3c),m/z=1602.6所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰為[β-CD+SIPI5358+H]+離子(見圖3d).與文獻(xiàn)[27]中結(jié)構(gòu)類似的SIPI5838比較,可以發(fā)現(xiàn)SIPI5838也可以與兩分子β-CD反應(yīng),并生成m/z= 1348.6的[2β-CD+SIPI5838+2H]離子,SIPI5358分子中哌嗪的鄰位連的是丁基,而SIPI5838分子中哌嗪的鄰位連的是甲基,烷基基團(tuán)的空間位阻對(duì)哌嗪衍生物與β-CD的結(jié)合也許會(huì)產(chǎn)生一定的影響,對(duì)這個(gè)問題還需做更多的工作才能作明確的解釋.

γ-CD與SIPI5358以5∶1混合反應(yīng)后得到的質(zhì)譜圖如圖4所示.圖4a為γ-CD與SIPI5358按5∶1混合反應(yīng)后得到的質(zhì)譜圖,圖4a中的三個(gè)離子的放大圖分別列于圖4(b,c,d),其中圖4a中m/z=1116.1所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰為[γ-CD-2SIPI5358+2H]2+離子(如圖4b),m/z=1539.9所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰為[2γ-CD+ SIPI5358＋H2O+2H]2+離子(如圖4c),m/z=1764.2所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰為[γ-CD+SIPI5358+H]+離子(如圖4d).上述結(jié)果表明,同β-CD與SIPI5358形成的非共價(jià)復(fù)合物的結(jié)果類似,γ-CD與SIPI5358之間形成的復(fù)合物也是以1∶2、1∶1、2∶1三種形式存在.

綜合比較圖2-4中相同摩爾比反應(yīng)物得到的1∶1復(fù)合物的質(zhì)譜峰強(qiáng)度,可以看出γ-CD與SIPI5358反應(yīng)強(qiáng)于α-,β-CD和SIPI5358反應(yīng),即三種環(huán)糊精和藥物結(jié)合的程度依次為γ-CD＞β-CD＞α-CD.這一結(jié)果可能與環(huán)糊精的分子的大小以及SIPI5358的結(jié)構(gòu)有關(guān).α-、β-、γ-CD的空腔容積分別為0.174、0.262和0.427 nm3,也就是說空腔內(nèi)徑 γ-CD＞β-CD＞α-CD.在CD包合物中,化合物被包在CD的空腔中,通常將CD稱為主體,而把進(jìn)入其空腔內(nèi)的化合物稱為客體.作為主體的CD與客體分子形式包合物的一個(gè)基本要求是尺寸的匹配,即對(duì)SIPI5358分子中的有機(jī)基團(tuán)具有識(shí)別能力.一般而言,由于α-、β-、γ-CD的空腔尺寸依次增大,可以穩(wěn)定包結(jié)不同大小的分子,如α-CD的空腔尺寸適合包結(jié)單環(huán)芳烴,β-CD空腔尺寸適合包結(jié)萘環(huán),而γ-CD的空腔尺寸適合包結(jié)苾、蒽等.由于SIPI5358分子中的兩端含有一個(gè)苯基和一個(gè)帶有—OCH3和—Cl的萘基,因此β-、γ-CD容易與萘基結(jié)合,而α-CD容易與苯基結(jié)合,導(dǎo)致三種環(huán)糊精和SIPI5358結(jié)合后生成的1∶1復(fù)合物穩(wěn)定程度依次為γ-CD＞β-CD＞α-CD,該結(jié)果也被溶解度實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[29],在該文中根據(jù)Higuchi-Connors法測(cè)得的SIPI5358與γ-CD、β-CD或α-CD形成的復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)分別為175.2、29.2、15.4 mol·L-1.

2.3 α-、β-、γ-CD和SIPI5358按各種比例混合后的質(zhì)譜檢測(cè)

為了確認(rèn)SIPI5358與環(huán)糊精生成的為特異性結(jié)合的非共價(jià)復(fù)合物,而不是分子團(tuán)簇離子,我們將α-、β-、γ-CD和SIPI5358按摩爾比為5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5的不同比例混合后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),改變反應(yīng)物的配比會(huì)影響質(zhì)譜峰的相對(duì)強(qiáng)度,但不會(huì)改變質(zhì)譜峰m/z的位置,可見反應(yīng)物的初始反應(yīng)比不影響最終產(chǎn)物的生成,只影響復(fù)合物的相對(duì)生成量.它說明了SIPI5358與環(huán)糊精生成的為特異性結(jié)合的非共價(jià)復(fù)合物,而不是非特異性結(jié)合的分子團(tuán)簇離子,因?yàn)榉磻?yīng)物的初始濃度比將會(huì)決定團(tuán)簇離子的大小,從而改變質(zhì)譜峰的位置.

2.4 混合液A和B質(zhì)譜測(cè)量結(jié)果

為了比較α-、β-、γ-CD和藥物SIPI5358同時(shí)反應(yīng)時(shí)相互之間的競爭關(guān)系,我們配制兩種不同的溶液.溶液A為3份SIPI5358先與α-、β-、γ-CD分別按摩爾比1∶5反應(yīng),然后再將反應(yīng)液混合在一起的混合溶液;而溶液B為3份SIPI5358同時(shí)與α-、β-、 γ-CD反應(yīng)的混合溶液B(摩爾比,nSIPI5358∶nCD=3∶5).溶液A和溶液B的質(zhì)譜圖分別如圖5a和圖5b所示.對(duì)比圖5a和5b，發(fā)現(xiàn)兩張圖中出現(xiàn)了三種環(huán)糊精和藥物按1∶1、1∶2、2∶1結(jié)合的主要產(chǎn)物.

圖5 混合溶液A(a)和B(b)電噴霧電離質(zhì)譜圖Fig.5 ESI-MS of mixture solutions A(a)and B(b) solution A:the reactant mixture of excess SIPI5358 with equimolar α-CD,β-CD,γ-CD,respectively;solution B:an equimolar mixture of α-CD,β-CD,γ-CD with excess SIPI5358

令人感興趣的是在α-CD、β-CD、γ-CD三種環(huán)糊精中任意兩種不同CD均可以與一個(gè)SIPI5358分子相結(jié)合并生成相應(yīng)的產(chǎn)物,它們分別為m/z=1297.0所對(duì)應(yīng)的[α-CD+β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+分子離子、m/z=1377.8所對(duì)應(yīng)的[α-CD+γ-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+分子離子、m/z=1459.0所對(duì)應(yīng)的[γ-CD+ β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+分子離子.值得一提的是在圖5中m/z=1539.9所對(duì)應(yīng)的[2γ-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+分子離子峰卻未觀察到,其主要原因可能是因?yàn)楫?dāng)一分子γ-CD與SIPI5358結(jié)合之后,較大的空洞內(nèi)徑使得另一γ-CD分子與SIPI5358分子中的苯基的鍵合作用不如β-CD或α-CD的強(qiáng).

圖5a和5b中兩兩對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰的相對(duì)強(qiáng)度發(fā)生了明顯的變化.在圖5b中,α-、β-CD和藥物結(jié)合的一價(jià)離子峰增強(qiáng),即m/z=1440.5所對(duì)應(yīng)[α-CD+ SIPI5358+H]+離子、m/z=1602.6所對(duì)應(yīng)的[β-CD+ SIPI5838+H]+離子信號(hào)增強(qiáng);另外多種二價(jià)離子的信號(hào)也增強(qiáng),m/z=1035.5所對(duì)應(yīng)的[β-CD+2SIPI5358+ 2H]2+離子、m/z=1377.8所對(duì)應(yīng)的[2β-CD＋SIPI5358+ H2O+2H]2+離子以及m/z=1116.1所對(duì)應(yīng)的[γ-CD+ 2SIPI5358+2H]2+離子和 m/z=1297.0所對(duì)應(yīng)的[α-CD+β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+離子峰強(qiáng)度均增強(qiáng),其余的峰強(qiáng)度無明顯變化.說明α-、β-、γ-CD同時(shí)和SIPI5358反應(yīng),與三種環(huán)糊精分別和藥物反應(yīng)結(jié)果是不同的,表明環(huán)糊精之間存在明顯的競爭關(guān)系.

2.5 串級(jí)質(zhì)譜分析結(jié)果

為了進(jìn)一步確認(rèn)β-CD和SIPI5358之間非共價(jià)復(fù)合物分子的組成,我們選擇了β-CD+SIPI5358混合溶液中的[2β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+和[β-CD-2SIPI5358+2H]2+產(chǎn)物離子進(jìn)行了串級(jí)質(zhì)譜分析,即選出m/z=1377.8對(duì)應(yīng)的[2β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+和m/z=1035.5對(duì)應(yīng)的[β-CD+2SIPI5358+2H]2+離子作為前驅(qū)體離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)過程和產(chǎn)物分析,結(jié)果如圖6所示.

碰撞能量固定為70 eV(＞70 eV,SIPI5358會(huì)解離),碰撞氣體密度CGT=80×1013molecules·cm-2.如圖6a所示,來自于前體離子[β-CD+2SIPI5358+2H]2+(m/z=1035.5)的斷裂碎片離子m/z=1602.6和m/z= 467.8分別可以歸屬于為[β-CD+SIPI5358+H]+和 [SIPI5358+H]+.進(jìn)一步增大碰撞氣體CGT至100× 1013molecules·cm-2,前體離子[β-CD+2SIPI5358+2H]2+完全解離,m/z=1035.5的離子峰信號(hào)消失,由此可見, m/z=1035.5對(duì)應(yīng)的前體離子是β-CD和SIPI5358按配合比1∶2結(jié)合的復(fù)合物.碰撞能量固定70 eV, CGT=80×1013molecules·cm-2時(shí),[2β-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+的CID實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜圖見(圖6b).圖6b中可以發(fā)現(xiàn)源于m/z=1377.8對(duì)應(yīng)的前體離子[2β-CD+ SIPI5358+H2O+2H]2+的斷裂碎片離子m/z=467.8和m/z=1153.1,它們分別可以歸屬于[SIPI5358+H]+和[β-CD+H2O+H]+離子,沒有出現(xiàn)β-CD和SIPI5358按配合比1∶1結(jié)合的[β-CD-SIPI5358+H2O+H]+離子.根據(jù)串級(jí)質(zhì)譜圖6可以推斷β-CD和SIPI5358反應(yīng)以后可以生成復(fù)合物,β-CD與SIPI5358在復(fù)合物中的配合比可以為1∶2或2∶1.

需要強(qiáng)調(diào)的是長期以來用電噴霧質(zhì)譜在氣相中測(cè)得的非共價(jià)復(fù)合物質(zhì)譜信號(hào)能否直接代表溶液中的產(chǎn)物還存在一定的爭議[30].在電噴霧過程中解離或生成分子團(tuán)簇(cluster)離子可能會(huì)造成測(cè)得的結(jié)果與溶液中的實(shí)際情況產(chǎn)生差異,在特定條件下電噴霧過程中可能會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合[31].一些重要的情況列舉如下:(1)某些非特異性結(jié)合的復(fù)合物離子比特異性結(jié)合的離子在動(dòng)力學(xué)上要穩(wěn)定;(2)某些復(fù)合物離子從溶液轉(zhuǎn)移到氣相的過程中會(huì)發(fā)生離子相互作用強(qiáng)化而疏水作用弱化;(3)在分析試劑濃度較高時(shí),會(huì)發(fā)生質(zhì)譜信號(hào)相互抑制作用.例如, Klassen等[32]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)一個(gè)給定濃度的糖和碳酸酐酶(carbonic anhydrase)而言,單糖、二糖以及親水的糖容易在納升噴霧過程中與碳酸酐酶形成非特異性結(jié)合.然而,非特異性結(jié)合對(duì)碳酸酐酶的結(jié)構(gòu)以及復(fù)合物的電荷態(tài)均不敏感,而且結(jié)合的配體數(shù)也遠(yuǎn)大于復(fù)合物的電荷態(tài).因此,下面結(jié)合傳統(tǒng)的溶液分析技術(shù)如紫外光譜等確認(rèn)非共價(jià)復(fù)合物的形成.

2.6 SIPI5358分別與α-,β-,γ-CD形成的復(fù)合物

的紫外光譜圖

為了驗(yàn)證SIPI5358可以和α-,β-,γ-CD在溶液中形成非共價(jià)復(fù)合物,而不是在氣相中形成的的分子團(tuán)簇,我們還測(cè)定了由SIPI55358和α-,β-,或γ-CD制備而成的復(fù)合物溶液的紫外光譜.

圖8 SIPI5358與β-CD混合物在不同反應(yīng)時(shí)間的熒光光譜圖Fig.8 Fluorescence spectra for the mixture of SIPI5358 and β-CD with different reaction time

在實(shí)驗(yàn)中我們選用190-260 nm區(qū)間對(duì)α-,β-, γ-CD和SIPI5358以及它們1∶1混合后經(jīng)反應(yīng)得到的混合物溶液進(jìn)行紫外光譜的檢測(cè),結(jié)果見圖7.

在圖7A中,曲線a,b分別代表α-CD溶液和SIPI5358溶液所測(cè)得的紫外光譜,曲線d則為兩者進(jìn)行簡單理論疊加后應(yīng)該出現(xiàn)的光譜,曲線c為實(shí)際測(cè)得兩者混合后的光譜圖.從圖中可以看到,如果藥物SIPI5358和α-CD是簡單疊加,則應(yīng)該在192.0 nm處都會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收.而實(shí)際得到的混合物吸收峰則發(fā)生了一定的偏移,即在192.5 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)吸收,除了峰位置發(fā)生偏移外,峰形也有變化,說明將SIPI5358和α-CD混合后,再進(jìn)行紫外光譜的檢測(cè),得到的紫外光譜不是反應(yīng)物簡單的疊加,而是有新物質(zhì)生成.類似地β-CD與SIPI5358反應(yīng)在193.1 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)吸收(圖7B),γ-CD與SIPI5358反應(yīng)在193.0 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)吸收(圖7C).γ-CD或β-CD與SIPI5358反應(yīng)后混合物吸收峰相對(duì)于簡單疊加的偏移均約為1.1 nm,大于α-CD與SIPI5358反應(yīng)后混合物吸收峰的偏移(0.5 nm).紫外光譜的結(jié)果表明CD和SIPI5358在溶液中可以生成非共價(jià)復(fù)合物,而γ-CD或β-CD與SIPI5358的結(jié)合強(qiáng)度要略大于α-CD.

圖9 藥物SIPI5358和不同濃度β-CD混合物的熒光光譜圖Fig.9 Fluorescence emission spectra of SIPI5358 and β-CD with different concentrationscSIPI5358=1×10-4mol·L-1;104cβ-CD/(mol·L-1)∶(a)0,(b)1.0,(c)2.0,(d)3.0, (e)4.0,(f)5.0,(g)6.0,(h)7.0,(i)8.0

表1 SIPI5358與β-CD結(jié)合的生成常數(shù)和擬合線性方程Table 1 Linear equations and Kfvalues of β-CD with SIPI5358

2.7 藥物SIPI5358與β-CD混合后的熒光光譜測(cè)定結(jié)果

從質(zhì)譜的結(jié)果來看,β-CD和藥物SIPI5358的反應(yīng)情況較好,于是用熒光光譜進(jìn)一步驗(yàn)證β-CD和藥物SIPI5358相互反應(yīng)及測(cè)定反應(yīng)的生成常數(shù).

圖8中,對(duì)應(yīng)0 min的曲線是未加β-CD的空白藥物溶液,濃度也是1×10-4mol·L-1.從圖8可以看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,藥物SIPI5358和β-CD混合以后,混合溶液的熒光強(qiáng)度會(huì)有所增加,說明在發(fā)射波長為366 nm時(shí)生成了一種熒光更強(qiáng)的物質(zhì),證明兩者發(fā)生了反應(yīng),反應(yīng)10 min以后熒光強(qiáng)度幾乎無變化,因此推測(cè)這一系列反應(yīng)都屬于快反應(yīng).

2.8 用熒光光度計(jì)測(cè)定SIPI5358與β-CD復(fù)合物的生成常數(shù)

圖9為SIPI5358在1×10-4mol·L-1的濃度下與不同濃度β-CD(反應(yīng)的熒光譜圖blank是未加環(huán)糊精的空白藥物,濃度單位均為mol·L-1).通過下式計(jì)算出β-CD和SIPI5358反應(yīng)的生成常數(shù)和擬合線性方程列于表1.

其中F0是空白溶液的熒光強(qiáng)度,F∞為所有SIPI5358完全反應(yīng)時(shí)的溶液的熒光強(qiáng)度.生成常數(shù)的平均值為Kf=3.45×103mol·L-1.

3 結(jié) 論

應(yīng)用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、串級(jí)質(zhì)譜(MS/ MS)并結(jié)合紫外光譜、熒光光譜技術(shù),研究了新型抗抑郁化合物SIPI5358(客體分子)與α-,β-,γ-CD(主體分子)所形成的非共價(jià)相互作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在溶液中,SIPI5358與α-,β-,γ-CD可以生成較為穩(wěn)定的非共價(jià)復(fù)合物.使用ESI-MS及MS/MS技術(shù),能夠確定三種環(huán)糊精與SIPI5358之間非共價(jià)復(fù)合物的生成,并且可以快速和準(zhǔn)確地確定復(fù)合物中主客體分子之間的配合比.研究證實(shí)藥物SIPI5358可以和α-CD生成1∶1結(jié)合的產(chǎn)物,與β-,γ-CD則可以分別生成配合比為1∶2、1∶1、2∶1的非共價(jià)復(fù)合物.將三種環(huán)糊精和藥物一起反應(yīng)時(shí),可以看出三種環(huán)糊精和藥物之間的反應(yīng)存在明顯的競爭關(guān)系.另外,紫外光譜和熒光光譜實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果和ESI-MS得到的結(jié)果較為吻合,均證明在溶液中有新的復(fù)合物生成.用熒光光譜測(cè)得的生成常數(shù)Kf為3.45×103mol·L-1.本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后利用質(zhì)譜等技術(shù)研究環(huán)糊精與其他藥物分子的非共價(jià)復(fù)合物打下了基礎(chǔ),并為以后解決提高藥物溶解度的問題提供了新的思路和理論依據(jù).

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∶March 5,2010;Revised∶June 7,2010;Published on Web:July 13,2010.

Non-Covalent Complexes of the Antidepressant Compound SIPI5358 with Cyclodextrins

HE Xiao-Dan1JIANG Dan1CHEN Chen1CHU Yan-Qiu1DING Chuan-Fan1,*WENG Zhi-Jie2LI Jian-Qi2,*
(1Shanghai Key Laboratory of Molecular Catalysis and Innovative Materials,Institute of Laser Chemistry, Department of Chemistry,Fudan University,Shanghai200433,P.R.China;2Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,Shanghai 200040,P.R.China)

Non-covalent complexes of α-,β-,and γ-cyclodextrin(CD)with the antidepressant compound SIPI5358 were investigated by electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS),tandem mass spectrometry(MS/MS),UV spectroscopy,and fluorescence spectroscopy.The ESI-MS experimental results revealed that SIPI5358 reacted with the α-,β-,and γ-CD to form complexes with different coordination numbers.The tandem mass spectra further confirmed the formation of non-covalent complexes of SIPI5358 with β-CD.Binding of the complexes was also confirmed by UV as well as fluorescence spectra.The formation constant Kfwas determined by fluorescence spectroscopy to be 3.45×103mol·L-1for the complex of SIPI5358 and β-CD.

Cyclodextrin;Antidepressant;Non-covalent complex;UV spectroscopy; Electrospray ionization mass spectrometry;Fluorescence spectroscopy

O641;O645

*Corresponding authors.DING Chuan-Fan,Email:cfding@fudan.edu.cn;Tel:+86-21-65105204.LI Jian-Qi,Email:lijq@sipi.com.cn.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(30772623)and National Project in Significant Creation of New Drugs During the Eleventh Five-Year Plan Period,China(2009ZX09103-047).

國家自然科學(xué)基金(30772623)及國家十一五項(xiàng)目重大新藥創(chuàng)制(2009ZX09103-047)資助項(xiàng)目