針刺對局灶性腦缺血大鼠缺血腦組織及血清白介素-8的影響*

郭永明，梁憲如

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸系，天津 300193；2.武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300162）

白介素-8（IL-8）是20世紀(jì)80年代后期發(fā)現(xiàn)的一種對炎性細胞具有趨化作用的細胞因子，在炎性反應(yīng)及缺血性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。局灶性腦缺血后缺血側(cè)腦組織發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，IL-8作為一種重要的炎性細胞因子，在這一病理生理過程中如何變化、發(fā)揮什么作用，針刺對其有何影響呢？本次實驗用放免法動態(tài)觀察了局灶性腦缺血大鼠腦組織及外周血IL-8的變化及針刺的干預(yù)效應(yīng)，旨在進一步探討腦缺血后炎癥反應(yīng)的發(fā)生機制及針刺治療腦缺血的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用Wistar大鼠130只（由天津市衛(wèi)生局實驗動物中心提供），體質(zhì)量（220±20）g，雌雄各半，隨機分缺血組、針刺組各50只、假手術(shù)組25只、正常組5只。前3組又分為3、6、12、24、48h各時段組，其中缺血組、針刺組每組各10只、假手組每組各5只。

1.2 模型的制作 缺血組及針刺組動物經(jīng)3%的戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，側(cè)臥位固定，于眼眶至耳的中點縱行切開皮膚約1 cm左右，分離并切去部分顳肌，暴露顳骨，做一個約3 mm的骨窗，輕抬腦，可見橫過嗅束向上走行的大腦中動脈（MCA），用加熱的不銹鋼絲輕輕接觸靠近嗅束上緣的大腦中動脈，使之快速凝閉，遇有血管破裂可用小棉球局部輕壓止血，術(shù)后創(chuàng)面敷少許抗生素（先鋒Ⅳ），縫合傷口并單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不凝閉MCA外，余手術(shù)步驟同模型組。

1.3 腧穴的選取及處理 根據(jù)大鼠穴位圖譜，針刺組選取“醒腦開竅”針法主穴人中、內(nèi)關(guān)，先針刺人中，用雀啄手法10次，繼刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，直刺捻轉(zhuǎn)提插瀉法1 min。3 h針刺組，手術(shù)后1 h針刺；6、12 h針刺組，手術(shù)后1 h針刺，處死前蓄積1次；24、48 h針刺組針2次/d，處死前蓄積1次。正常組、假手術(shù)組及缺血各組動物同樣抓取，不做其他處理。

1.4 指標(biāo)檢測及方法

1.4.1 標(biāo)本收集 各組動物在規(guī)定的時間點摘眼球取血，分離血清，-20℃冰箱保存，待測。然后迅速斷頭取腦，在冰盤上分開兩大腦半球，剝離大腦中動脈栓塞（MCAO）側(cè)皮質(zhì)，稱質(zhì)量，按 400 mg：1 mL 的比例加生理鹽水作組織勻漿，2000 r/min離心15 min，取上清，-20℃冰箱保存，待測。

1.4.2 IL-8 的測定 采用 FT-6 SDF γ-晶體閃爍計數(shù)儀（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院放免室提供），用放射免疫分析法測定各組動物腦組織及血清中IL-8含量，IL-8檢測試劑盒由北京東亞免疫技術(shù)研究所提供，操作程序嚴(yán)格按照藥盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 局灶性腦缺血大鼠腦組織IL-8含量的變化及針刺的影響 局灶性腦缺血后3 h腦組織IL-8含量明顯升高，12 h達高峰，然后逐漸降低，至48 h仍維持在較高水平，各時段模型組與同時段假手術(shù)組及正常組比較均具有顯著性差異（P＜0.01），各時段假手術(shù)組與正常組比較無顯著差異（P＞0.05）。治療后3 h針刺組腦組織IL-8含量較模型組略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），6～48 h各時段針刺組與同時段模型組比較腦組織IL-8含量明顯降低（P＜0.01），與同時段假手術(shù)組及正常組比較無顯著差異（P＞0.05），表明局灶性腦缺血后腦組織IL-8含量明顯增高，“醒腦開竅”針法可在缺血早期（6 h）明顯抑制腦組織IL-8含量升高，并持續(xù)至48 h使其含量基本維持在正常范圍。各組動物腦組織IL-8含量變化見表1。

表1 各組動物腦組織白介素-8含量(±sTab.1 The content of IL-8 in the brain of all groups of rats(±sμg/g

表1 各組動物腦組織白介素-8含量(±sTab.1 The content of IL-8 in the brain of all groups of rats(±sμg/g

注：與同時段模型組比較：※P＜0.05，※※P＜0.01；與同時段假手術(shù)組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01；與正常組比較：▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。

組別模型組針刺組假手術(shù)組正常組3 h 3.225±0.639▼▼★★2.787±0.504▼▼★★1.310±0.4351.044±0.5396 h 3.370±0.765▼▼★★0.885±0.669※※1.072±0.2801.044±0.53912 h 3.480±0.892▼▼★★0.610±0.543※※1.048±0.1451.044±0.539組別模型組針刺組假手術(shù)組正常組24 h 3.135±0.808▼▼★★0.870±0.508※※1.148±0.5801.044±0.53948 h 2.875±0.540▼▼★★1.090±0.641※※0.814±0.2971.044±0.539

2.2 局灶性腦缺血大鼠血清IL-8含量的變化及針刺的影響 局灶性腦缺血后各時段模型組血清IL-8含量較同時段假手術(shù)組和/或正常組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），治療后 6、12及 48 h針刺組血清IL-8含量顯著低于同時段模型組（P＜0.05，P＜0.01），表明局灶性腦缺血后血清IL-8含量升高，“醒腦開竅”針法可使其含量降低。各組動物血清IL-8含量變化見表2。

表2 各組動物血清白介素-8含量(±sTab.2 The content of IL-8 in the serum of all groups of rats(±sμg/L

表2 各組動物血清白介素-8含量(±sTab.2 The content of IL-8 in the serum of all groups of rats(±sμg/L

注：與同時段模型組比較：※P＜0.05，※※P＜0.01；與同時段假手術(shù)組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01；與正常組比較：▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。

組別模型組針刺組假手術(shù)組正常組3 h 0.708±0.413▼0.571±0.2270.482±0.1890.408±0.2746 h 0.827±0.218▼▼★0.485±0.253※※0.498±0.0920.408±0.27412 h 0.769±0.197▼★0.535±0.249※0.432±0.1320.408±0.27424 h 0.806±0.421▼▼★0.769±0.225▼0.492±0.1180.408±0.27448 h 0.961±0.293▼▼★★0.635±0.222※※0.404±0.0780.408±0.274

3 討論

IL-8是一種重要的白細胞趨化因子，可由許多細胞產(chǎn)生，主要吸引中性粒細胞、噬酸粒細胞、噬堿粒細胞及T細胞[1]，腦內(nèi)神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞受IL-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的刺激亦可誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生[2]。IL-8屬于一類典型的炎性介質(zhì)，可在炎癥反應(yīng)過程中趨化中性粒細胞，使細胞表達黏附分子，導(dǎo)致細胞游離Ca2+濃度迅速而短暫升高，并誘導(dǎo)細胞變形、脫顆粒反應(yīng)、呼吸爆發(fā)和溶酶體酶釋放，使細胞得以激活[3]；IL-8不僅在白細胞趨化中起關(guān)鍵作用，而且和IL-8相關(guān)趨化性多肽能在幾分鐘內(nèi)快速活化整合素α、β鏈的連接分子，增加白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附和跨膜移行[4]，因此，IL-8在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。

研究表明，腦缺血時腦組織及外周血中IL-8發(fā)生明顯改變，Kostulas等[5]通過原位雜交法測定發(fā)病1～7 d的腦缺血患者單核細胞內(nèi)IL-8 mRNA的表達，并用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定血漿中IL-8水平，發(fā)現(xiàn)缺血性卒中患者單核細胞IL-8 mRNA表達增加，血漿中IL-8水平升高，兩者呈正相關(guān)，認為多形核白細胞（PMNL）由血循環(huán)到達腦缺血部位可能與IL-8有關(guān),IL-8可能參與了白細胞向缺血損傷部位聚集的反應(yīng)。潘旭東[6]等采用雙抗體夾心法間接ELISA法觀察了缺血性腦血管?。↖CVD）患者血清IL－8水平的變化，發(fā)現(xiàn)ICVD患者血清IL－8高于正常人，發(fā)病1周內(nèi)高于1周后，大面積腦梗死者高于小面積腦梗死者，提示IL-8與腦缺血損傷有關(guān)，它與腦缺血病程呈負相關(guān)，與梗死面積呈正相關(guān)，說明腦缺血損傷引起IL-8水平的升高，而IL-8水平的升高又加重腦損傷的程度。其他學(xué)者[7-10]也有類似報道，認為IL-8在“缺血-炎癥/免疫反應(yīng)-缺血或出血發(fā)生-再缺血”這一循環(huán)過程中具有關(guān)鍵的觸發(fā)作用，是神經(jīng)系統(tǒng)損傷免疫機制中的重要環(huán)節(jié)，早期IL-8增高提示預(yù)后不良。

本次實驗發(fā)現(xiàn)腦缺血后腦組織及血清IL-8含量顯著增高，以腦組織中增高尤為明顯，各時段平均增高幅度達到3倍左右，該結(jié)果與上述文獻報道基本一致，推測缺血后缺血皮質(zhì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞合成和分泌IL-1β、TNF-α迅速增加，從而激活神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及內(nèi)皮細胞等分泌合成大量IL-8，導(dǎo)致缺血早期腦內(nèi)及血清IL-8含量急劇增高，IL-8與其他炎性細胞因子如IL-1β、TNF-α等共同作用，快速活化整合素α、β鏈的連接分子，并誘導(dǎo)細胞黏附分子（ICAM-1）等黏附分子表達上調(diào)，由此造成白細胞與缺血區(qū)血管內(nèi)皮細胞的牢固黏附，加之缺血局部存在高濃度的IL-8，因此不斷趨化吸引炎性細胞穿越血管壁，進入腦組織并向周圍浸潤，進入腦組織的炎性細胞又合成分泌大量IL-8，由此進一步造成缺血側(cè)腦組織IL-8持續(xù)增高。筆者認為缺血側(cè)腦組織IL-8的升高既是形成炎性反應(yīng)的始動因素之一，同時又是炎性反應(yīng)的結(jié)果，而血清中IL-8含量的高低可能間接反應(yīng)腦損害的程度。針刺后腦組織及血清中IL-8含量顯著降低，尤以腦組織中IL-8降低更為明顯，說明針刺可通過減少IL-8的合成分泌而抑制炎性細胞的黏附及浸潤，阻斷由IL-8所介導(dǎo)的一系列炎癥反應(yīng)的發(fā)展，從發(fā)揮腦保護作用，推測對IL-8這種顯著的良性調(diào)整作用可能是“醒腦開竅”針法治療缺血性腦血管疾病的重要作用機制之一。

[1]畢愛華.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：72-73.

[2]曹學(xué)兵，孫圣剛，黃懷鈞，等.CINC/IL-8與腦缺血再灌注損傷[J].國外醫(yī)學(xué)·神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊，1999，26（3）：155-158.

[3]曹秋云，潘旭東.腦缺血再灌注損傷與白細胞介素-8的關(guān)系[J].國外醫(yī)學(xué)·腦血管疾病分冊，2000，8（5）：267-270.

[4]霍紅梅，張志琳，包仕堯.腦缺血損傷與抗黏附分子治療研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)·腦血管疾病分冊，2000，8（4）：213-216.

[5]Kostulas N,Kivisakk P,Huang Y,et al.Ischemic stroke is associated with a systemic increase of blood mononuclear cells expression interleukin-8 mRNA[J].Stroke,1998,29(2):462-466.

[6]潘旭東，曹秋云，王海燕，等.缺血性腦血管病患者血清IL-8水平的變化及其臨床意義[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2000，13（5）：295-296.

[7]陳光輝，張仁良，吳學(xué)豪，等.急性腦卒中患者血清一氧化氮和炎性細胞因子測定及其臨床意義[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，1999，16（1）：30-32.

[8]劉 楠，鄭 安，葉欽勇，等.腦血管疾病患者血清TNF、IL-8的變化及臨床意義[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，1998，12（5）：220-223.

[9]葉志其，張國忠，黃建斌.電針對腦缺血大鼠再灌注期血清IL-8、IL-10 的實驗研究[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，7（4）：1-3.

[10]盧志河，張國忠.電針治療大鼠腦缺血再灌注期血清白細胞介素8 水平的調(diào)節(jié)[J].中國臨床康復(fù)，2006，43（10）：156-158.