牛肝菌中的尼古丁成因研究報告

彭云霞 馬曉剛 李云飛 熊 清 趙永昌 車泉 劉自強(qiáng)

(1.云南出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心,昆明 650028;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,昆明 650054;3.云南省牛肝菌協(xié)會,昆明 650032;4.中國食品土畜進(jìn)出口商會食用菌分會,北京 100062)

1 研究方法及樣本

1.1 檢測方法 本項目組所采用的檢測方法是中國正式公布的由云南CIQ實驗室同EUROFONS蘇州實驗室共同起草的進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2397-2009《進(jìn)出口食品中尼古丁檢測方法》,同時近期云南CIQ實驗室還參加了歐盟基準(zhǔn)實驗室CRL組織的國際實驗室間能力驗證實驗,檢測結(jié)果滿意。2009年11月4～5日在德國漢堡由歐盟ESA協(xié)會主辦的中歐尼古丁成因研究會上確認(rèn):EUROFINS方法為尼古丁篩選檢測方法,云南CIQ方法為確證方法。

1.2 樣本采集 各類牛肝菌樣本700份,其中鮮樣100份,速凍鮮樣73份,鹽漬加工樣品59份,干片468份;其他食用菌干片樣本96份。對云南主產(chǎn)區(qū)及四川、東北的食用菌生長周邊環(huán)境樣本55份進(jìn)行尼古丁含量的檢測,其中根系土壤樣品30份,水樣品10份,大氣樣品15份。實驗室培養(yǎng)的人工菌絲體4種,分別是:本研究在實驗室內(nèi)人工培育的羊肚菌 (Morchella esculenta)、暗褐色網(wǎng)柄牛肝菌 (Phlebopus portentosus)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、青霉菌 (Penicillum sp.)。

2.2 樣本來源 云南食用菌主產(chǎn)區(qū)的樣本由項目組到產(chǎn)地直接采集后在實驗室進(jìn)行加工,其采集加工過程經(jīng)嚴(yán)格控制,保證樣本不受外界環(huán)境的污染;歐洲區(qū)的牛肝菌干片樣本是在歐盟市場上購買;中國其他產(chǎn)區(qū)的實驗樣本由云南省牛肝菌協(xié)會會員在當(dāng)?shù)厥召徍筇峁?大氣樣本委托云南省楚雄、思茅、麗江環(huán)境監(jiān)測站對當(dāng)?shù)卮髿猸h(huán)境按相關(guān)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行采集所得。

2.3 菌絲體培養(yǎng)方法 真菌菌絲體由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供,其菌絲體培養(yǎng)條件:試驗菌株在YPDA(0.2%酵母膏,0.2%蛋白胨,2%葡萄糖,1.2%瓊脂粉)斜面上于25℃下培養(yǎng)7～8天,培養(yǎng)的菌絲接入YPD液體培養(yǎng)基 (500 mL的三角瓶裝入200 mL的培養(yǎng)基),接種后搖床振蕩培養(yǎng) (25℃,150 r/min)10天,每個菌株設(shè)3個重復(fù)。培養(yǎng)好后采用離心收集法收集菌絲體,8 000 r/min離心20 min菌絲體培養(yǎng)液,棄上清收集沉淀即為培養(yǎng)所需的菌絲體,于40℃下儲存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r使用不接入菌絲的培養(yǎng)基同上述操作條件同步培養(yǎng)作空白對照試驗。

為保證實驗結(jié)論的科學(xué)準(zhǔn)確,本項目研究組專門送9份比對樣本到EUROFINS蘇州實驗室進(jìn)行檢測,同期收集了由中國出口商送至德國第三方實驗室檢測所得結(jié)果的數(shù)據(jù),對其進(jìn)行分析研究。

2 試驗結(jié)果

2.1 項目研究組的檢測結(jié)果數(shù)據(jù) 具體數(shù)據(jù)詳見表1～表7。

表1 人工培育的菌絲體中的尼古丁含量

表2 云南產(chǎn)區(qū)鮮牛肝菌子實體樣本的尼古丁含量

表3 云南產(chǎn)區(qū)牛肝菌干片中的尼古丁含量

表4 云南產(chǎn)區(qū)速凍及鹽漬牛肝菌中的尼古丁含量

表5 其他產(chǎn)區(qū)牛肝菌干片中的尼古丁含量

表6 其他食用菌的尼古丁含量

表7 歐洲產(chǎn)區(qū)不同等級牛肝菌干片的檢測結(jié)果

2.2 其他實驗室的驗證實驗結(jié)果 EUROFINS蘇州實驗室對不同等級地區(qū)牛肝菌干片的尼古丁含量檢測結(jié)果見表8;另對產(chǎn)地為云南祥云的A級牛肝菌干片子實體不同部分的檢測結(jié)果,菌蓋的尼古丁含量為3 470μg/kg,菌柄為968μg/kg。

不同加工方式的牛肝菌中尼古丁的含量有差異。據(jù)來自云南20個非水洗牛肝菌干片樣本和20個水洗牛肝菌干片的檢測結(jié)果,其尼古丁平均含量分別為1 278μg/kg和678μg/kg,其含量水平各為210～1 300μg/kg和 170～3 540 μg/kg。這兩組數(shù)據(jù)由出口商送往德國第三方實驗室檢測后所得。意大利對于牛肝菌尼古丁含量分析結(jié)果列于表9。

表8 不同等級不同地區(qū)牛肝菌干片的檢測結(jié)果

表9 意大利對干牛肝菌尼古丁含量的分析結(jié)果

3 食用菌含尼古丁的成因分析

從上述實驗數(shù)據(jù)中可以看出,尼古丁廣泛存在于不同國家、不同地區(qū)、不同加工方式、不同種類的野生及人工種植的食用菌中。盡管本研究的實驗驗證因時間關(guān)系還只能作為間接證據(jù),但足以證明食用菌中的尼古丁是內(nèi)源產(chǎn)生的。

3.1 尼古丁外源性污染的排查 尼古丁可能的污染源包括含煙堿類農(nóng)藥的施用,加工中與煙草的接觸污染,以及生長環(huán)境中大氣、水、土的污染。

(1)輸歐牛肝菌的生長環(huán)境中含煙堿類農(nóng)藥的施用及污染的排查。牛肝菌是野生產(chǎn)品,生長在海拔1 400米以上的廣大山林中,沒有必要也不可能更做不到對其施用農(nóng)藥;而中國批準(zhǔn)使用的含尼古丁的農(nóng)藥共5種,主要是用在人工種植的柑橘、蘋果、茶、小麥、菜豆、黃瓜及十字花科植物中。這些作物主要種植在農(nóng)田或坡地的無林地上,而牛肝菌生長的區(qū)域是有林地,兩者的種植區(qū)域沒有交叉,不會因?qū)ζ渌魑锸┯棉r(nóng)藥而對牛肝菌造成污染;在牛肝菌的實際生長區(qū)域中,上述作物的種植區(qū)主要在居民集中的平地或坡地上,而牛肝菌則是生長在高于這些區(qū)域的山地上,由于水從高處往低處流,不會將低地處施用的農(nóng)藥帶到高地上;大氣循環(huán)是在全球很大的一個范圍內(nèi)進(jìn)行的,局部區(qū)域的農(nóng)藥施用并不總會因大氣循環(huán)而對本區(qū)域的植物造成污染,對大氣樣本的檢測數(shù)據(jù)也說明云南野生菌主產(chǎn)區(qū)的大氣并不存在尼古丁的污染。

(2)輸歐牛肝菌的生長和加工與煙草的接觸污染情況的排查。第一,牛肝菌必須生長在較高海拔的林地上,保持比平地或坡地低的溫度及較少的陽光直射,而烤煙必須生長在平地或坡地的無林地上,陽光的照射能促進(jìn)其有機(jī)物質(zhì)的合成,兩者的最適生長溫度、濕度及光照條件是不一樣的,因而其生長區(qū)域相距甚遠(yuǎn),更不可能交叉,不存在所謂根系延伸污染的問題;且牛肝菌的生長區(qū)域海拔高于烤煙種植區(qū)域,不存在水流帶來的污染。所以,在生長區(qū)過程中不會出現(xiàn)因與煙草接觸而帶來的污染。第二,目前云南出口牛肝菌的生產(chǎn)加工企業(yè)是嚴(yán)格按食品加工衛(wèi)生控制規(guī)范要求進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)管的,在生產(chǎn)及加工區(qū)內(nèi)嚴(yán)禁吸煙,即使有個別企業(yè)管理失范,在生產(chǎn)過程中偶有個別人員吸煙,牛肝菌中的尼古丁也只會出現(xiàn)在個別的產(chǎn)品中,而不會被歐方普遍檢出。云南牛肝菌干片的生產(chǎn)方式采用的是傳統(tǒng)的熱風(fēng)干燥,這種干燥方式與烤煙房并無任何關(guān)系。香味是烤煙最重要的品質(zhì)指標(biāo)之一,對烤煙種植者來說,烤煙的經(jīng)濟(jì)價值遠(yuǎn)高于牛肝菌,一旦牛肝菌自身濃郁的芳香氣味進(jìn)入烤煙房內(nèi),就會對烤煙氣味造成不良的影響,降低其經(jīng)濟(jì)價值。因此,云南省煙草行業(yè)在全省范圍內(nèi)實施了非常嚴(yán)格的煙草烤房的標(biāo)準(zhǔn)化管理,絕不會允許牛肝菌與烤煙在同一區(qū)域內(nèi)干燥加工的情況發(fā)生。

(3)牛肝菌生長環(huán)境 (大氣、水、土)的污染情況排查。檢測結(jié)果顯示,云南野生菌主產(chǎn)區(qū)的大氣、土壤、水等環(huán)境樣本中的尼古丁含量極低,只是PPB級 (1×10-9),而中國四川、東北產(chǎn)區(qū)土壤中尼古丁含量同云南食用菌主產(chǎn)區(qū)含量相當(dāng),云南食用菌的生長環(huán)境并不存在尼古丁的污染。同時,包括歐盟國家在內(nèi)的各類實驗室在全球范圍內(nèi)產(chǎn)區(qū)的各類野生食用菌中都檢出了尼古丁,且其平均含量水平不存在顯著差異,證實了各類野生食用菌中尼古丁的存在同環(huán)境因素污染無關(guān)。如果是人為污染,那么只可能是偶然性地在少數(shù)樣本中檢出尼古丁,而不可能在中歐各個檢測機(jī)構(gòu)所有受檢的食用菌樣本中都檢出。

3.2 尼古丁是食用菌產(chǎn)品內(nèi)源性次生代謝產(chǎn)物的實驗論證

(1)鮮牛肝菌子實體尼古丁的檢測情況。100份鮮牛肝菌子實體試驗樣本均由研究人員親自到產(chǎn)區(qū)采集,無一例外地均檢出了尼古丁,鮮品中尼古丁的含量在35～65μg/kg。除牛肝菌外,擔(dān)子菌門中其他科屬食用菌中也均可檢出尼古丁。被檢出尼古丁的食用菌包括:野生菌類中的美味牛肝菌,羊肚菌,松茸,塊菌,黑木耳,榛蘑,虎掌菌,雞油菌,青頭菌,冬蟲夏草等;人工栽培菌中的香菇、平菇、木耳等。不過,不同種屬、不同菌齡間的尼古丁含量水平有所差異。

(2)對實驗室內(nèi)人工培養(yǎng)的4種菌絲體的尼古丁檢測情況。結(jié)果均檢出了尼古丁。除在擔(dān)子菌門的多種食用菌子實體中及人工菌絲體檢出尼古丁外,也在黑曲霉和青霉菌等真菌的菌絲體中檢出。證實了尼古丁是真菌類物種生長過程中普遍產(chǎn)生、存在的一種次生代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)生機(jī)理有待于深入地研究。

(3)來自世界各產(chǎn)區(qū)的牛肝菌干片及其他食用菌產(chǎn)品中均可以檢出尼古丁。在2009年11月4～5日“中歐牛肝菌中尼古丁成因研討會”和2009年12月3日CIAA向歐盟消保司的陳述會上,除本項目組外,法國、意大利、德國等國的研究機(jī)構(gòu)交流的檢測數(shù)據(jù)也毫無爭議地證實了這一事實的存在。各國的實驗檢測數(shù)據(jù)充分證實含尼古丁的食用菌包括了野生食用菌和人工種植食用菌,兩者的生長環(huán)境控制和生長方式完全不同。尼古丁廣泛存在的事實充分說明食用菌中的尼古丁是一種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。

4 影響各類牛肝菌中尼古丁含量水平主要因素的實驗

各產(chǎn)區(qū)的牛肝菌干片中均可檢出尼古丁,歐洲4個國家26份樣本尼古丁含量為306～1 645μg/kg;云南產(chǎn)區(qū)尼古丁的平均含量為986μg/kg(398份樣本);中國其他產(chǎn)區(qū)50份樣本尼古丁的平均含量為822μg/kg。同一產(chǎn)區(qū)不同等級的牛肝菌尼古丁含量不等,而不同級別在不同產(chǎn)區(qū)的含量并不呈現(xiàn)同樣的變化規(guī)律 (上表3,5,7,8),說明牛肝菌含量水平同產(chǎn)地?zé)o關(guān)。但項目研究小組發(fā)現(xiàn)等級低的樣本尼古丁含量普遍較高,經(jīng)有針對性的檢測分析發(fā)現(xiàn),影響牛肝菌中尼古丁含量的主要因素有以下幾種。

表10 受損與未受損樣本中的尼古丁含量

4.1 自然受損后的牛肝菌干片中尼古丁含量顯著增高 在對同一貿(mào)易等級牛肝菌干片的實驗發(fā)現(xiàn),自然受損后的牛肝菌干片中尼古丁含量值明顯較高 (表10)。這一現(xiàn)象在對新鮮松茸的實驗中也同樣得到證實,10份受損鮮松茸的尼古丁含量為 157～305μg/kg,而未受損的10份鮮松茸僅為13～77μg/kg。

上述實驗結(jié)果從內(nèi)源性次生代謝產(chǎn)物的角度可以得到科學(xué)解釋:菌體在受刺激后因生物體出于自我保護(hù)的應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生應(yīng)激物質(zhì)尼古丁。這種應(yīng)急反應(yīng)在生物界的其他物種中也普遍存在。從這一觀點出發(fā)可以對下述實驗結(jié)果進(jìn)行如下解釋。

(1)為什么鮮牛肝菌子實體同牛肝菌干片中尼古丁的含量水平并不呈現(xiàn)干鮮比為9倍的關(guān)系 (此換算比例應(yīng)只是適用于外來污染物),而是增高很多。那是因為鮮牛肝菌子實體的干燥過程同樣是一種外來損害的刺激,隨之不斷產(chǎn)生尼古丁直至轉(zhuǎn)換酶失活,從而使尼古丁含量積累增高。

(2)為什么速凍及鹽漬牛肝菌中尼古丁檢出值較低。其原因有二:一是尼古丁極易溶于水,我們分取速凍菌中水樣和速凍菌子實體進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其水中尼古丁含量高于子實體部分的含量;二是速凍及鹽漬都能很快地使子實體中的反應(yīng)酶失活,尼古丁產(chǎn)生的時間進(jìn)程短。

表11 牛肝菌不同樣本的尼古丁平均含量

4.2 牛肝菌子實體不同部位的尼古丁含量不一,其孢子產(chǎn)生器官菌管中的含量最高,說明其尼古丁的產(chǎn)生可能與其生殖活動有關(guān)。采集鮮牛肝菌樣本和對同一子實體牛肝菌干片樣本按菌蓋和菌柄分別進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),不同等級菌蓋中尼古丁的含量均高于菌柄,其中含量最高部位是菌管,EUROFINS蘇州實驗室的檢測數(shù)據(jù)也證實了這一點 (表11)。

5 牛肝菌干片中含尼古丁的食用風(fēng)險評估及相關(guān)建議

圖1 尼古丁化學(xué)結(jié)構(gòu)式

5.1 尼古丁的化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 尼古丁又稱煙堿,CAS號54-11-5,分子式C10H14N2,相對分子質(zhì)量162;化學(xué)名稱為:1一甲基一2(3一吡啶基)吡咯烷,結(jié)構(gòu)式列于圖1。煙堿來源于自然界,無殘留。天然的煙堿在室溫下為無色或淡黃色的油狀液體,在20℃下的密度為1.0071 kg/m3,沸點為247℃ 。當(dāng)pH值大于10時,主要以煙堿分子態(tài)存在,能與多種酸反應(yīng)成鹽,所生成的鹽大多易溶于水和有機(jī)溶劑。

5.2 食用菌中尼古丁的限量合理性問題

(1)一個基本的事實是美味牛肝菌在中歐兩國都有悠久的食用歷史,從未發(fā)生過任何食用安全事件。此外,茄科植物中含有尼古丁是公認(rèn)的事實,我們檢測了番茄和茄子,其尼古丁含量分別為68μg/kg和25μg/kg,皆同鮮牛肝菌相當(dāng),而茄子則是WHO/FAO推薦的十大健康食品之一,對其食用并無任何限制。

目前,歐盟對牛肝菌干片的臨時限量是2.3 mg/kg,瑞士對干蘑菇的限量為4.5 mg/kg。歐盟制定臨時限量的科學(xué)依據(jù)是什么?如前所述,野生牛肝菌中尼古丁并不是使用殺蟲劑后的殘留物,而是內(nèi)源次生代謝產(chǎn)物,因而其限量不應(yīng)適用396/2005號法規(guī)中0.01 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。

(2)確定尼古丁的限量應(yīng)充分考慮牛肝菌產(chǎn)品的食用方式。據(jù)調(diào)查,牛肝菌干片的食用方式主要有兩類:一是打碎磨細(xì)后作為調(diào)味料使用,二是直接食用。前者的日攝入量極少,而后者則需要浸泡清洗后再烹制食用,在此過程中微量的尼古丁將被溶解于水中,留在食用子實體中的含量極少。我們將檢測過尼古丁含量的牛肝菌干片樣本按食用方式先浸泡半小時,取出煮沸半小時后再測試其尼古丁的含量,結(jié)果是,處理前兩個樣本的尼古丁含量各為13 558μg/kg和11 978μg/kg,而處理后的尼古丁含量各為1 007μg/kg和571μg/kg,后者只是前者的1/10～1/20,完全符合現(xiàn)行臨時限量標(biāo)準(zhǔn)。因此現(xiàn)時所依據(jù)的暴露評估數(shù)據(jù)并不完善。

以上實驗數(shù)據(jù)已經(jīng)證實,由于牛肝菌等野生食用菌中尼古丁的含量多少,是人為不可控的,因此要確定野生食用菌中尼古丁的自然本底值是很困難的。同樣的事例也發(fā)生在香菇中:香菇中的甲醛已被證實為香菇內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,干香菇中的甲醛含量范圍為5～1 500 mg/kg,平均含量達(dá)266 mg/kg。但現(xiàn)今各主要貿(mào)易國并未對香菇中的甲醛制定任何限量標(biāo)準(zhǔn),因為專家認(rèn)為,香菇中的氨基酸自然代謝產(chǎn)生的甲醛會在食物的烹飪過程中揮發(fā),不會對人體產(chǎn)生致癌等危害;而尼古丁同樣也屬極易揮發(fā)的物質(zhì),其天然含量比甲醛低了近2個數(shù)量級,制定限量顯然是不合理。歐盟官方應(yīng)充分考慮到牛肝菌中的尼古丁是內(nèi)源性次生代謝產(chǎn)物,美味牛肝菌食用歷史悠久,不曾出現(xiàn)中毒案例,有必要將尼古丁作為豁免物質(zhì),取消對其含量設(shè)限的要求,以保證中歐牛肝菌貿(mào)易的正常進(jìn)行,保障產(chǎn)業(yè)鏈上各方的合法權(quán)益。