E2F3在膀胱癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤臨床特征的關(guān)系*

胡海龍 吳長利 孫 巖 張文嵐 韓瑞發(fā)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，95%以上的膀胱癌是膀胱移行細(xì)胞癌，其生物學(xué)行為多變，腫瘤大小、分級、分期、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等與預(yù)后密切相關(guān)[1]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控密切相關(guān)。如果細(xì)胞周期調(diào)控發(fā)生異常，受損害的DNA得不到及時修復(fù)，細(xì)胞繼續(xù)分裂，因遺傳不穩(wěn)定，可轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞。E2F3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是在細(xì)胞周期調(diào)控過程中起重要作用的調(diào)控蛋白。本研究旨在探討膀胱移行細(xì)胞癌中E2F3表達(dá)與其生物學(xué)行為的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 免疫組化標(biāo)本選用我院2003年4月—2006年4月手術(shù)切除的74例膀胱黏膜組織存檔蠟塊并經(jīng)病理證實。術(shù)前均未行放療、化療與免疫治療。其中膀胱移行細(xì)胞癌組 64例，男49例，女15例；年齡 34～86 歲，平均（51.4±28.8）歲。按照WHO膀胱腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)（1999）分級：G112例，G228例，G324例；TNM 分期：Ta～142例；T2～422例。正常黏膜組10例，均為前列腺增生開放性手術(shù)時留取，年齡48～72歲，平均（58.6±18.4）歲。2組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝ 1.068，P＞0.05）。RT－PCR檢測所需標(biāo)本為 2005年10月—2006年10月間膀胱移行細(xì)胞癌組織標(biāo)本52例，男33例，女19例；年齡 34～86 歲，平均（52.0±27.6）歲。對照組為同期正常膀胱黏膜 10例，年齡 47～76 歲，平均（71.2±9.4）歲，2 組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝ 1.106，P ＞ 0.05）。

1.2 方法

1.2.1 E2F3 mRNA的半定量分析 應(yīng)用TRIZOL進(jìn)行組織中總RNA的提取，RNA質(zhì)量經(jīng)紫外分光光度計測定，并應(yīng)用甲醛凝膠電泳觀察其降解情況。應(yīng)用兩步法RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行PCR擴增及鑒定：在20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中加入組織總RNA 1 μg，然后加入寡脫氧胸苷酸、三磷酸脫氧核苷、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液加水至 20 μL，混勻后 38 ℃ 2 h，95 ℃ 2 min。50 μL PCR 反應(yīng)體系加入 cDNA 1 μL、PCR 緩沖液、Taq酶、dNTP、E2F3和GAPDH引物各一對及三蒸水，在PCR上擴增。取5 μL PCR產(chǎn)物與0.5 μL加樣電泳緩沖液混勻后，點于電泳孔中，5 V/cm電壓進(jìn)行電泳，1 h后關(guān)閉電源。將凝膠放于Kodak 440凝膠成像分析系統(tǒng)上成像，分別獲得各電泳條帶上E2F3和GAPDH電泳條帶的平均光密度（mean optical density，MOD）數(shù)值，并將二者數(shù)值相比，進(jìn)行E2F3 mRNA表達(dá)的半定量分析。

1.2.2 組織切片的制備及E2F3免疫組化染色 選出典型的腫瘤組織標(biāo)本蠟塊，連續(xù)切片6張，厚4 μm，于35℃～40℃恒溫水浴鍋的水面上完全展開。除1張做HE染色外，其余均用經(jīng)APES（防脫片劑）處理的玻片撈片并標(biāo)記，于65℃恒溫烤箱中烤片6 h，自然冷卻后裝盒備用。染色玻片經(jīng)病理醫(yī)師復(fù)查、核實病理診斷與分級。采用即用型二步法（En Vision）免疫組織化學(xué)方法。其中一抗E2F3為鼠抗人單克隆抗體，稀釋度為1∶100。操作步驟按照超敏非生物素檢測試劑盒PV-9000步驟實施，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知的基因表達(dá)組織片作陽性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 免疫組化產(chǎn)物陽性呈淺黃色-棕褐色細(xì)顆粒狀。每例切片均隨機觀察5個高倍視野（×400），計數(shù)1 000個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞所占的百分比。按陽性細(xì)胞所占的百分比評分：0分為陽性細(xì)胞＜5%，1分為陽性細(xì)胞5%～24%，2分為陽性細(xì)胞25%～49%，3分為陽性細(xì)胞50%～74%，4分為陽性細(xì)胞≥75%。按染色強度評分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色強度與陽性細(xì)胞百分比評分的乘積≤1分為表達(dá)陰性，2～12分為陽性。E2F3表達(dá)陽性石蠟切片置于Olympus顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)棕黃色為陽性信號。手動連續(xù)取5個高倍視野。由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細(xì)胞圖像輸入Image-pro plus形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量分析。計算每視野陽性染色的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，并取5個視野的積分光密度平均值作為分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，3組樣本以上計量資料用方差分析，多樣本均數(shù)間的多重比較用Dunnett-t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱正常黏膜及膀胱移行細(xì)胞癌組織中E2F3蛋白的表達(dá) 免疫組化產(chǎn)物陽性呈淺黃色-棕褐色細(xì)顆粒狀，E2F3蛋白定位于細(xì)胞核，偶見于細(xì)胞漿，見圖1。在膀胱移行細(xì)胞癌中E2F3的陽性表達(dá)率為37.5%（24/64），陽性表達(dá)程度IOD為（6.569 8±3.227 5）×104，正常膀胱黏膜則無表達(dá)。不同組織學(xué)分級和病理分期患者E2F3蛋白陽性表達(dá)情況，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。不同性別、年齡、腫瘤數(shù)目、復(fù)發(fā)情況患者E2F3蛋白陽性表達(dá)情況，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 E2F3在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)（×100）

2.2 膀胱正常黏膜及膀胱移行細(xì)胞癌組織中E2F3 mRNA的表達(dá) 5 S、18 S、28 S核糖體 RNA條帶清晰，18S、28S兩者條帶之比約為2∶1，說明所提取的樣品總RNA具有完整性，見圖2。各凝膠在成像分析系統(tǒng)上成像，可見E2F3（243 bp）和GAPDH（492 bp）2條電泳帶，其中內(nèi)參GAPDH在不同惡性程度的膀胱癌和正常膀胱黏膜中均有表達(dá)，且表達(dá)量大致相等；而E2F3僅在部分膀胱癌組織中有表達(dá)，在正常黏膜中無表達(dá)，見圖3。不同臨床病理特征患者間E2F3 mRNA水平比較結(jié)果與蛋白陽性表達(dá)情況相符，見表1。

表1 膀胱移行細(xì)胞癌組織中E2F3蛋白及E2F3 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 不同膀胱組織中總RNA甲醛變性凝膠電泳

圖3 E2F3 mRNA在不同膀胱組織中的表達(dá)情況

3 討論

膀胱癌的發(fā)生必須有多種致癌因素長期在細(xì)胞內(nèi)作用，導(dǎo)致原癌基因的激活，繼而經(jīng)過一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程最終影響細(xì)胞周期的運轉(zhuǎn)。在復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中又因為抑癌基因的缺失或失活不能修復(fù)受損的DNA，也不能使細(xì)胞進(jìn)入正常的凋亡過程，從而使攜帶有異常DNA的細(xì)胞無限制復(fù)制，最終導(dǎo)致膀胱癌的發(fā)生。

人類膀胱癌中不同染色體部位存在多種DNA的改變，包括一些基因的失活如 RB、TP53、和INK4A/ARF等；還包括一些基因的擴增與過表達(dá)如MDM2、CCND1/Cyclin D1和ERBB2及一些基因的突變激活如H-RAS及FGFR3等。Simon等[2]通過比較基因組雜交（CGH）研究膀胱癌染色體的調(diào)節(jié)區(qū)曾多次發(fā)現(xiàn)在染色體6p22處有基因的擴增。Evans等[3]用多重定量聚合酶鏈反應(yīng)分析59例膀胱癌也精確定位染色體6p22處有基因擴增。Veltman等[4]在研究膀胱癌的基因擴增和過表達(dá)時認(rèn)為6p22處擴增的基因為E2F3。Feber等[5]用CGH分析cDNA微序列對膀胱癌的細(xì)胞系進(jìn)行篩選，得到3種膀胱癌細(xì)胞系（TCCSUP、5637和 HT1376）中染色體6p22處存在基因擴增，同時發(fā)現(xiàn)基因擴增的高峰區(qū)為一段6.5 Mb含有12個基因的區(qū)域，該區(qū)域跨越E2F3基因位點。

E2F3屬于E2F家族，定位于染色體6p22，全長91.5 kb，其編碼的E2F3轉(zhuǎn)錄蛋白由465個氨基酸組成，分子質(zhì)量49 ku。它參與調(diào)控細(xì)胞周期與DNA復(fù)制并與多種致癌和抑癌基因有聯(lián)系[6]。E2F3的激活受到pRB蛋白的調(diào)控，pRB與E2F3在細(xì)胞周期G1期結(jié)合，繼而抑制了E2F3的轉(zhuǎn)錄活性。

本研究發(fā)現(xiàn)在正常膀胱黏膜中E2F3無表達(dá)，在移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)率很高，且與膀胱癌的組織學(xué)分級及臨床分期關(guān)系密切。隨著腫瘤數(shù)目增多及腫瘤復(fù)發(fā)，E2F3的表達(dá)也有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Leone等[7]曾報道膀胱癌中染色體6p22處擴增子與腫瘤分級程度有關(guān)。Feber等[5]的研究也表明隨著腫瘤分期的增加，E2F3的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這些與本文的研究結(jié)果一致，由此可見，E2F3的過表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞分化程度和浸潤深度有關(guān)。

E2F3處于細(xì)胞周期調(diào)控的核心環(huán)節(jié)，其高表達(dá)可致腫瘤細(xì)胞異常增殖，而凋亡受到限制。如果腫瘤細(xì)胞中E2F3基因表達(dá)降低，膀胱腫瘤細(xì)胞是否會發(fā)生與E2F3高表達(dá)相反的效應(yīng)，是否能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增生并促進(jìn)其凋亡仍未明了。筆者已經(jīng)構(gòu)建了針對E2F3基因的質(zhì)粒干擾載體[8]，并將通過后續(xù)的以E2F3為靶點的膀胱癌基因沉默體外試驗來探討上述問題。

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