斑馬魚HAS2基因的克隆、抗體制備及分析

楊建華,楊 青,吳秀山,袁婺洲,王躍群,李永青，莫小陽,萬永奇

(湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)及魚類發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心臟發(fā)育研究中心，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

透明質(zhì)酸合成酶(HAS)是一類存在于質(zhì)膜上，能夠特異性作用于透明質(zhì)酸(HA)合成過程中的酶．該家族有3種同工酶：HAS1、HAS2和HAS3．HAS1在整個(gè)生命過程均有表達(dá)，雖然由其催化生成的高分子質(zhì)量HA在各種細(xì)胞中水平很低,但對(duì)維持機(jī)體的正常作用卻必不可少[1-4]．HAS2在胚胎發(fā)育階段表達(dá)顯著，由其催化合成的高分子質(zhì)量HA具有維持組織結(jié)構(gòu)和體液平衡的重要作用,從而在機(jī)體組織擴(kuò)張和生長(zhǎng)過程中意義重大[5-8]．通過敲除小鼠HAS1或HAS3基因，發(fā)現(xiàn)小鼠仍可以存活；但是敲除HAS2基因時(shí)，小鼠卻難以生存．這是因?yàn)樵谛∈蟮呐咛グl(fā)育期HAS2的缺乏將會(huì)導(dǎo)致HA合成不足，引發(fā)嚴(yán)重的發(fā)育缺陷，如卵黃囊和心臟缺陷[9-11]．然而，針對(duì)不同分子質(zhì)量HAS差異的研究，目前仍十分有限．斑馬魚是進(jìn)一步研究HAS2在心臟發(fā)育中功能理想模型，作者克隆了斑馬魚HAS2基因的片段，成功實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)并制備了效價(jià)較高、特異性較好的HAS2多克隆抗體，對(duì)進(jìn)一步研究利用斑馬魚研究HAS2基因生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌E.coli DH5a,E.coli BL21菌株和pGEX-4T-1載體為本實(shí)驗(yàn)室提供；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalI，TagDNA聚合酶購(gòu)自晶美公司；pMD18-T載體和連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；柱式DNA膠回收試劑盒(離心柱型)購(gòu)自博大泰克公司；蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、RNase等購(gòu)自上海sangon公司；弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司；Glutathione SepharoseTM4B購(gòu)自Amersham Biotech公司；新西蘭大白兔購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院．

1.2 斑馬魚HAS2基因生物信息學(xué)分析

應(yīng)用UCSC程序(http://genome.ucsc.edu)，根據(jù)已克隆的人的HAS2基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找斑馬魚HAS2基因，分析該基因在染色體中的位置、外顯子與內(nèi)含子數(shù)目、基因全長(zhǎng)和開放閱讀框的堿基數(shù)目，及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目；SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)分析蛋白質(zhì)HAS2的結(jié)構(gòu)域；Matchcode軟件用于核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列的匹配；DNAstar軟件用于DNA序列及進(jìn)化關(guān)系分析；Primer Premier5.0軟件用于酶切位點(diǎn)的分析和PCR引物設(shè)計(jì)；凝膠分析系統(tǒng)用于分析蛋白相對(duì)含量．

1.3 斑馬魚HAS2基因片段的分離及序列測(cè)定

用熱酚法[12-13]抽提斑馬魚成魚組織總RNA 1 mg，按試劑盒說明書分離純化出mRNA，并以之為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(cDNA PCR Kits，TaKaRa公司)合成斑馬魚cDNA．根據(jù)蛋白質(zhì)抗體制備親水性分析，選擇親水性較好的一段序列作為擴(kuò)增片段，以所得到的cDNA文庫(kù)為模板，用根據(jù)斑馬魚HAS2基因序列設(shè)計(jì)合成的引物(5′端引物：5-GAATTCATGAGATGTGATAAAGC-3，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和3′端引物：5-GTCGACACACACACTTATTATTGAG-3，含SalI酶切位點(diǎn))，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 42 s，反應(yīng)32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，PCR擴(kuò)增出來的片段大小為530 bp，所得PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，通過EcoRⅠ和SalI酶切鑒定后，在上海英峻公司測(cè)序分析．

1.4 斑馬魚HAS2蛋白原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

pMD18-T-HAS2質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalI雙酶切，回收HAS2基因片段，與同以EcoRⅠ和SalI雙酶切的pGEX-4T-1質(zhì)粒相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃過夜；挑選陽性克隆，制備質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和SalI雙酶切鑒定后，進(jìn)行測(cè)序分析．將鑒定正確的pGEX-4T-1-HAS2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21菌株；將含重組子pGEX-4T-1-HAS2的BL21菌株在LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)過夜，以1∶50比例接種于200 mL LB培養(yǎng)液，37 ℃振蕩培養(yǎng)OD 600至0.6；加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，在不同溫度、不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，選擇最佳的誘導(dǎo)條件收集細(xì)胞，重懸于pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，超聲破菌(超聲6 s，間歇8 s)，離心后收集全蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定．考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色后，用凝膠圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算蛋白質(zhì)相對(duì)含量．

將收集到的誘導(dǎo)菌液超聲至澄清，收集沉淀蛋白，分別用2，4，6，8 mol/L的尿素洗滌包涵體蛋白．經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，切取目的蛋白條帶后與適量PBS混合，將純化得到的GST-HAS2目的蛋白0.6 mg按體積比1∶1與弗氏完全佐劑混合，皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔；在第14 d、第21 d再將目的蛋白0.15 mg與弗氏不完全佐劑混合并免疫．第28天從兔胸主動(dòng)脈放血．血液在37 ℃靜置1 h后，放置4 ℃以析出血清，得到多克隆抗體．

1.5 Western blotting分析抗體特異性

將含pGEX-4T-1-HAS2重組子和含pGEX-4T-1的BL21菌株按上述方法用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用體積分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE膠對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳，將制備的HAS2多克隆抗體稀釋一定比例后作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔為二抗，用Western blotting方法對(duì)含pGEX-4T-1-HAS2重組子和含pGEX-4T-1的BL21宿主菌株誘導(dǎo)總蛋白進(jìn)行分析，并用ECL法顯色．以檢測(cè)抗體的特異性；用GST抗體分析結(jié)果作為對(duì)照．

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚HAS2基因的生物信息學(xué)分析及克隆

斑馬魚HAS2基因位于8號(hào)染色體上，cDNA全長(zhǎng)為2 895 bp，包含兩個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，編碼由553個(gè)氨基酸組成的、相對(duì)分子質(zhì)量為6.1×104的蛋白質(zhì)(圖1)．利用斑馬魚HAS2基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Homologene搜索，發(fā)現(xiàn)在人類、小鼠、大鼠、猩猩、狗、原雞、果蠅中都存在斑馬魚HAS2的同源基因．

圖1 由核酸序列推斷出的HAS2氨基酸序列

經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出大小為530 bp的HAS2基因片段，將目的片段純化回收后，與pMD18-T連接．用EcoRⅠ和SalI雙酶切pMD18-T-HAS2質(zhì)粒，產(chǎn)生與HAS2基因片段大小一致的酶切條帶，大小為530 bp(圖2)．表明HAS2基因片段已插入到pMD18-T載體中．測(cè)序結(jié)果與NCBI登陸序列一致．

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及GST-HAS2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化

用EcoRⅠ和SalI酶切pMD18-T-HAS2質(zhì)粒和pGEX-4T-1載體， pMD18-T-HAS2質(zhì)粒酶切取下來的斑馬魚HAS2基因片段回收后連接到pGEX-4T-1載體中，構(gòu)建成pGEX-4T-1-HAS2重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和SalI酶切鑒定分析結(jié)果：酶切片段的大小與HAS2基因片段大小是一致的(圖3)，表明斑、馬魚HAS2基因片段已插入到載體pGEX-4T-1．

M: SM0331 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：EcoR I/SalI雙酶切結(jié)果 M: SM0331 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：EcoR I /SalI雙酶切結(jié)果 圖2 pMD18-T-HAS2質(zhì)粒酶切鑒定 圖3 pGEX-4T-1-HAS2重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定

pGEX-4T-1-HAS2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21宿主菌后，用IPTG誘導(dǎo)，分別在未誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3，4，5，6，7 h收集細(xì)胞，用PBS重懸后超聲破菌，取全蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定．結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后大量表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量約為4.5×104的GST-HAS2融合蛋白(圖4)，該GST-HAS2融合蛋白量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，IPTG誘導(dǎo)6 h后達(dá)到最高，約占總蛋白40%左右．

M：SM0671 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：誘導(dǎo)空載體； 2，3，4，5，6，7分別是誘導(dǎo)0，3，4，5，6，7 h全蛋白圖4 GST-HAS2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將超聲后收集到的沉淀蛋白分別用2，4，6，8 mol/L尿素洗滌后，SDS-PAGE電泳分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示經(jīng)尿素處理過后蛋白純度明顯提高，而各尿素洗滌效果基本一樣(如圖5)，所以后面實(shí)驗(yàn)選擇2 mol/L的尿素進(jìn)行洗滌．

M：SM0671蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化前的GST-HAS2蛋白; 2，4，6，8 分別是2 mol/L，4 mol/L，6 mol/L，8 mol/L尿素處理后的上清； 3，5，7分別是2 mol/L，4 mol/L，6 mol/L尿素處理后的蛋白沉淀圖5 GST-HAS2融合蛋白的純化結(jié)果

2.3 HAS2多克隆抗體特異性檢測(cè)

利用制備的HAS2多克隆抗體對(duì)含有重組子pGEX-4T-1-HAS2和含有空載體pGEX-4T-1兩種BL21菌株的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blotting分析，以GST抗體進(jìn)行Western blotting分析作為對(duì)照．結(jié)果表明：在用HAS2抗體進(jìn)行分析時(shí)，在pGEX-4T-1-HAS2誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白中能檢測(cè)到4.5×104特異性條帶，該帶的蛋白大小與GST-HAS2融合蛋白大小一致，而pGEX-4T-1誘導(dǎo)表達(dá)蛋白則沒有4.5×104特異性條帶出現(xiàn)；而用GST抗體分析時(shí)，則在pGEX-4T-1-HAS2誘導(dǎo)表達(dá)的GST-HAS2融合蛋白的4.5×104處和pGEX-4T-1誘導(dǎo)表達(dá)的GST蛋白的2.6×104處均有條帶出現(xiàn)(圖6)．說明利用GST-HAS2融合蛋白制備的HAS2多克隆抗體對(duì)HAS2蛋白有抗性，對(duì)GST沒有抗性，證明HAS2多克隆抗體制備是成功的，達(dá)到了用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要．

A: 用制備的HAS2多克隆抗體對(duì)pGEX-4T-1-HAS2和pGEX-4T-1在大腸桿菌BL21中的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè);B: 用GST抗體對(duì)pGEX-4T-1-HAS2和pGEX-4T-1在大腸桿菌BL21中的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè);1：含pGEX4T-1-HAS2的BL21誘導(dǎo)表達(dá)后總蛋白；2：含pGEX-4T-1的BL21誘導(dǎo)表達(dá)總蛋白．圖6 HAS2多克隆抗體特異性的Western blot檢測(cè)

3 討論

為了研究基因HAS2在斑馬魚心臟發(fā)育中的功能，作者對(duì)該基因進(jìn)行親水性分析，選取親水性較好的一段序列，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出了斑馬魚HAS2基因片段，并將其插入到pGEX-4T-1表達(dá)載體上．pGEX表達(dá)載體是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)載體系列，表達(dá)產(chǎn)物為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和目的基因產(chǎn)物的融合體，可用Glutathione SepharoseTM4B純化出來．目的蛋白與GST蛋白以融合蛋白形式在大腸桿菌BL21中表達(dá)是目前使用很廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一,它不僅表達(dá)量高,而且具有純化方便的優(yōu)點(diǎn)[14]．

在進(jìn)行融合蛋白誘導(dǎo)時(shí)，蛋白極易以包涵體的形式表達(dá)，而包涵體形成后的缺點(diǎn)是需變性、復(fù)性等復(fù)雜處理過程后才能得到可溶性融合蛋白質(zhì)．于是30 ℃誘導(dǎo)過夜，超聲后利用合適濃度的尿素純化包涵體，去除包涵體表面的不溶性雜蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示尿素純化后的融合蛋白純度較高．將切膠獲得的GST-HAS2融合蛋白免疫新西蘭大白兔．由于分子質(zhì)量較大的蛋白容易激活免疫,所以保留了GST部分．末次免疫1周后,兔血清按一定比例稀釋進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示所得抗體具有良好的特異性．它為將來運(yùn)用免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫沉淀、胚胎抗體染色等手段深入研究HAS2基因的功能奠定了基礎(chǔ)．

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