Enterobacter cloacaeZ0206細(xì)菌胞外多糖的體外抗氧化活性研究

徐春蘭,欽傳光,牛衛(wèi)寧,尚曉婭

西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,西安 710072

Enterobacter cloacaeZ0206細(xì)菌胞外多糖的體外抗氧化活性研究

徐春蘭,欽傳光＊,牛衛(wèi)寧,尚曉婭

西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,西安 710072

本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì) Enterobacter cloacaeZ0206菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),以制備胞外多糖,并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究。通過(guò)產(chǎn)多糖菌 E.cloacaeZ0206的深層發(fā)酵制備細(xì)菌胞外多糖,在此基礎(chǔ)上對(duì)其清除DPPH自由基、超氧陰離子、抑制羥自由基的能力以及還原力等四個(gè)方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明,深層發(fā)酵制備的 E.cloacaeZ0206胞外多糖產(chǎn)量為 6.62 g/L,其在 5 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率分別達(dá)到 61.57%和 40.08%。提示 E.cloacaeZ0206細(xì)菌胞外多糖具有顯著的抗氧化能力,具有開發(fā)為抗氧化類食品或藥品的潛力。

Enterobacter cloacae;胞外多糖;自由基;抗氧化

隨著自由基生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的日趨深入和發(fā)展,活性氧自由基的致病作用機(jī)制研究正引起人們的巨大關(guān)注[1-3]。大量的研究表明,抗氧化劑可以通過(guò)自由基清除作用機(jī)制來(lái)降低或緩解細(xì)胞損傷甚至凋亡[4,5],降低疾病的發(fā)生率。然而,化學(xué)合成類抗氧化劑大多有毒副作用,因此,尋找低毒或無(wú)毒的天然抗氧化劑具有十分重要意義。

多糖是自然界中含量最豐富的物質(zhì)之一,也是與人類生活緊密相關(guān)的一類生物高分子。多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多種重要的生物學(xué)功能,因此,對(duì)多糖的研究已成為功能食品界的熱門領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)外近年來(lái)對(duì)于多糖的抗氧化作用進(jìn)行了廣泛的研究[6,7],并有人據(jù)此解釋了多糖抗衰老功效的藥理機(jī)理,多糖的抗氧化作用已經(jīng)成為最為活躍的研究課題之一。通常植物和藻類來(lái)源的多糖較為普遍,但近些年來(lái),微生物來(lái)源的多糖也引起人們的廣泛關(guān)注,尤其是細(xì)菌和真菌來(lái)源的胞外多糖,因其易于分離純化而且產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)中頗受人們青睞[8,9]。

本研究首次對(duì)從肉靈芝上分離的陰溝腸桿菌Enterobacter cloacaeZ0206進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),并對(duì)其所分泌的胞外多糖 (Exopolysaccharide,EPS)的體外抗氧化活性進(jìn)行研究,以期為 E.cloacaeZ0206胞外多糖藥物及功能性食品研究開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacaeZ0206,由浙江大學(xué)汪以真教授饋贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良 PDA培養(yǎng)基:20%的馬鈴薯浸汁,蛋白胨3 g,酵母提取物 3 g,蔗糖20 g,瓊脂16 g,蒸餾水定容至 1000 mL,自然 pH值;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:改良的PDY培養(yǎng)基 (不加瓊脂的改良 PDA培養(yǎng)基);20%的馬鈴薯浸汁的制備:將馬鈴薯 200 g洗凈去皮切片,加蒸餾水煮沸半個(gè)小時(shí),4層紗布過(guò)濾,濾液于 4℃下冷藏 24 h,5000 r/min離心,棄沉淀得到的上清液即20%的馬鈴薯浸汁。

1.1.3 主要試劑和儀器

葡萄糖、無(wú)水乙醇、丙酮、正丁醇、硫酸亞鐵、鹽酸、乙醚、氯仿、Vc均為國(guó)產(chǎn)分析純;1,1-二苯基苦味?；诫?DPPH)購(gòu)自 Sigma公司;鄰苯三酚購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。752型紫外可見分光光度計(jì),由上海第三分析儀器廠生產(chǎn);DK-8D數(shù)顯電熱恒溫水槽,由上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn);EYELA N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,由日本東京理化器械株式會(huì)社生產(chǎn);D-78532 Tuttlingen、Universal R臺(tái)式冷凍離心機(jī),德國(guó);冷凍干燥機(jī)(ChristALPHA 1-2),德國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 E.cloacaeZ0206胞外多糖(EPS)的制備

取出冷藏的 E.cloacaeZ0206菌種,室溫放置 1h后,在 PDA培養(yǎng)基上 2次活化后,接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行試管發(fā)酵培養(yǎng),30℃往復(fù)振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間 10 h,得到搖瓶發(fā)酵種子液。2000 mL搖瓶?jī)?nèi)裝入 500 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,121℃蒸汽滅菌20 min,接種種子液,發(fā)酵時(shí)間 48 h,得到含有 E.cloacaeZ0206的發(fā)酵液。發(fā)酵液于 50℃濃縮為原體積的 1/10,90℃水浴 1 h,5000 rpm離心 15 min,收集上清液,加入 3～5倍體積預(yù)冷的 95%乙醇,4℃靜置 24 h后,5000 rpm離心 15 min,沉淀真空干燥,即得到粗多糖粉末。將其溶于適量蒸餾水,Sevag法除蛋白,反復(fù)進(jìn)行多次至無(wú)蛋白層,然后用自來(lái)水透析和蒸餾水各透析 24 h,透析液中加無(wú)水乙醇,置 4℃冰箱中醇沉過(guò)夜,再離心分離,沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌 2次,真空干燥,即得到 E.cloacaeZ0206胞外多糖精品 (EPS)。其中多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法,蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.2 清除DPPH自由基試驗(yàn)

準(zhǔn)確地將 EPS配成 5.0 mg/mL,用超純水將該溶液稀釋成 6種濃度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5.0 mg/mL。以維生素 C(Vc)為對(duì)照品。稱取 20 mg的DPPH用無(wú)水乙醇溶解定容至 500 mL。試驗(yàn)分為樣品組和空白對(duì)照組:取 2 mL 40 mg/L的DPPH溶液加入 10 mL具塞的試管中,再加入 2 mL樣品溶液,空白對(duì)照組以超純水代替樣品溶液,充分混勻,室溫下避光反應(yīng) 30 min后,在 517 nm處測(cè)定吸光度。EPS清除 DPPH自由基的能力由下式計(jì)算: DPPH自由基清除率(%)=(A0– A1)/A0×100%,式中A0為空白對(duì)照的平均吸光度值,A1為試樣的平均吸光度值。

1.2.3 清除羥自由基試驗(yàn)

將 EPS用雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為 5 mg/mL的多糖溶液,并稀釋成 6個(gè)不同濃度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。各取 2 mL上述濃度的多糖溶液,依次加入 6 mmol/L的 FeSO4溶液 2 mL,混勻,6 mmol/L的 H2O2溶液 2 mL,混勻,靜置 30 min后于 510 nm處測(cè)其吸光度值?？瞻讓?duì)照組以雙蒸水代替多糖溶液,以維生素 C(Vc)做對(duì)照,臨用前以雙蒸水配制。羥自由基的清除率以下式計(jì)算:羥自由基清除率 (%)=(A0– A1)/A0×100%,式中A0為空白對(duì)照的平均吸光度值,A1為試樣的平均吸光度值。

1.2.4 清除超氧陰離子自由基試驗(yàn)

將 EPS用雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為 5 mg/mL的多糖溶液,并稀釋成 6個(gè)不同濃度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。取 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)4.5 mL,置于 25℃水浴中預(yù)熱25 min,分別加入 1 mL不同濃度的多糖溶液和 0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液,空白對(duì)照組以雙蒸水代替多糖溶液,混勻后在 25℃水浴中反應(yīng) 5 min,加入 1 mL 8 mol/L的 HCl終止反應(yīng),于 299 nm處測(cè)吸光度。超氧陰離子的清除率以下式計(jì)算:超氧陰離子的清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%,式中 A0為空白對(duì)照的平均吸光度值,A1為試樣的平均吸光度值。

1.2.5 還原能力的測(cè)定

將 EPS用雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為 5 mg/mL的多糖溶液,并稀釋成 6個(gè)不同濃度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL,各取 1 mL上述濃度的多糖溶液,加入 pH=6.6的磷酸鹽緩沖液 2.5 mL、1%鐵氰化鉀 2.5 mL,混合均勻后于 50℃水浴中保溫 20 min,再加入10%的三氯乙酸 2.5 mL,混勻,以3000 rpm離心 10 min,移取上清液 2.5 mL于試管中,加蒸餾水2.5 mL和 0.1%FeCl30.5 mL,常溫反應(yīng) 5 min后于 700 nm處測(cè)定吸光度值。用Vc做對(duì)照,臨用前用雙蒸水配制。

2 結(jié)果與討論

2.1 E.cloacaeZ0206胞外多糖的制備及其多糖和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

將產(chǎn)多糖菌 E.cloacaeZ0206進(jìn)行深層發(fā)酵后,發(fā)酵液經(jīng)濃縮、水煮醇沉、離心,冷凍干燥等過(guò)程,得到白色粉末為胞外多糖粗品,產(chǎn)率為 6.62 g/L;進(jìn)一步經(jīng) Sevag法脫蛋白,丙酮、乙醚洗滌,真空冷凍干燥,得到白色胞外多糖精品 (EPS)。用葡萄糖為對(duì)照品,用苯酚-硫酸法測(cè)得粗多糖中多糖的含量為67.5%,精制多糖中多糖含量為 97.86%,糖含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見下圖 1。用牛血清白蛋白為對(duì)照品,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得粗多糖中蛋白含量為20.8%,精制多糖中蛋白含量為 2.14%,蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見下圖 2。

2.2 E.cloacaeZ0206胞外多糖對(duì) DPPH自由基的清除活性

EPS對(duì) DPPH自由基的清除能力以清除率表示,清除率越高,說(shuō)明該多糖抗氧化作用越強(qiáng)。EPS與Vc對(duì)DPPH自由基清除作用的試驗(yàn)結(jié)果如圖 3所示。DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,若受試物能清除它,則提示受試物具有降低羥自由基、烷自由基和過(guò)氧自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)的作用。DPPH自由基有個(gè)單電子,在 517 nm有強(qiáng)吸收,其乙醇溶液呈深紫色,加入受試物后,在 517 nm可以監(jiān)測(cè)其對(duì)DPPH自由基清除效果。由圖3可見,EPS和Vc對(duì)DPPH自由基均有不同程度抑制作用,隨著濃度的增大 EPS和Vc清除能力接近,濃度 1.25 mg/mL時(shí)清除率已達(dá)54.49%,濃度為 5 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到 61.57%,這些結(jié)果說(shuō)明EPS在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基具有一定得清除活性。

圖 3 E.cloacaeZ0206胞外多糖和 Vc對(duì) DPPH自由基的清除能力(±s,n=5)Fig.3 Scavenging effects of EPS and Vc on DPPH radicals (±s,n=5)

2.3 E.cloacaeZ0206胞外多糖對(duì)羥自由基的清除活性

圖 4 E.cloacaeZ0206胞外多糖和 Vc對(duì)·OH的清除能力(±s,n=5)Fig.4 Scavenging effects of EPS and Vc on hydroxyl free radicals(±s,n=5)

羥自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)。在反應(yīng)體系中 H2O2和 Fe2+混合發(fā)生 Fenton反應(yīng),生產(chǎn)具有很高反應(yīng)活性的·OH,其能被水楊酸有效的捕捉,并生成有色物質(zhì);但若加入具有清除作用的物質(zhì),便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng),從而使有色產(chǎn)物生成量減少。因而可用吸光值的變化來(lái)反映該多糖對(duì)·OH的清除能力。從圖 4可見,在 0.156～5 mg/ mL的有效濃度范圍內(nèi),隨著 EPS濃度的增加,其清除·OH的作用逐漸增強(qiáng),在 5 mg/mL時(shí)對(duì)·OH的清除率達(dá) 40.08%。

2.4 E.cloacaeZ0206胞外多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性

超氧陰離子自由基是基態(tài)氧接受一個(gè)電子后形成的第一個(gè)氧自由基,可以經(jīng)過(guò)一序列反應(yīng)生成其它的氧自由基。多糖分子上均有還原性的半縮醛羥基,能與超氧陰離子自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng),從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?！で宄适欠从乘幬锟寡趸饔玫闹匾笜?biāo)之一。EPS與 Vc對(duì)·自由基清除作用的試驗(yàn)結(jié)果如圖 5所示,由圖 5可見, EPS對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力相對(duì)較弱,在濃度為 5 mg/mL時(shí),清除率僅為 13.68%。

圖 5 E.cloacaeZ0206胞外多糖和 Vc對(duì) ·的清除能力 (±s,n=5)Fig.5 Scavenging effects of EPS and Vc on superoxide anion free radicals(±s,n=5)

2.5 E.cloacaeZ0206胞外多糖的還原能力

抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基的,還原力越強(qiáng),抗氧化性越強(qiáng)。藥物還原力的大小在一定程度上反映了其預(yù)防性抗氧化功能的強(qiáng)弱。因此,可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的大小。EPS與 Vc的還原力的試驗(yàn)結(jié)果如圖 6所示。從圖 6可見,在 0.156 mg/mL～5 mg/mL的有效濃度范圍內(nèi),隨著 EPS濃度的增加,還原力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為 0.156 mg/mL時(shí),多糖的吸光值為 0.029;當(dāng)質(zhì)量濃度為 5 mg/mL時(shí),多糖的吸光值為 0.535,提示 EPS濃度具有一定的還原能力。

已知自由基對(duì) DNA、蛋白質(zhì)、酶和脂質(zhì)等生物分子具有氧化損傷作用,從而導(dǎo)致機(jī)體的衰老和多種病變[1]?？寡趸嗵堑陌l(fā)現(xiàn),與其他外源性抗氧化劑相比,抗氧化多糖具有低毒、安全來(lái)源廣等特點(diǎn)。作為外源性抗氧化劑,多糖在生物體內(nèi)發(fā)揮作用更為復(fù)雜,它可直接參與催滅自由基的途徑外,還可能與通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑的活性相關(guān)[10,11]。多糖可以作為一種天然的生物抗氧化劑進(jìn)行復(fù)配,增強(qiáng)人體健康的保護(hù)作用。但為最終獲得抗氧化活性高的目標(biāo)化合物,為新藥或保健品的開發(fā)研究奠定理論基礎(chǔ),還需要進(jìn)一步開展體內(nèi)生物功效以及抗氧化作用與其構(gòu)效關(guān)系的研究[12]。目前對(duì)多糖的抗氧化活性研究一般采用體外模型,即以清除自由基的效率以及還原能力的大小等為檢測(cè)指標(biāo),從離體或整體水平上衡量多糖抗氧化作用的大小[13]。Wang等報(bào)道 1株成團(tuán)泛菌 (Pantoea agglom erans)多糖對(duì)羥自由具有顯著的清除能力[14]。

EPS具有清除 DPPH自由基和羥自由基的作用,并且隨著糖濃度的增加,對(duì)DPPH和羥自由基的清除力增強(qiáng),呈明顯的量效關(guān)系;對(duì)鄰苯三酚體系產(chǎn)生的·具有一定的清除作用,但清除率低于 Vc對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用。從其對(duì)幾種自由基的清除作用來(lái)看,EPS對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng),其對(duì)活性氧自由基的清除作用可能存在一定得選擇性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 EPS在體外對(duì)活性氧自由基均有清除作用,從而能夠清除體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多氧自由基,阻斷體內(nèi)自由基反應(yīng)鏈的作用,并在抗氧化劑抗衰老方面具有一定的作用,是一種很有開發(fā)潛力的抗氧化、防衰老的食品或藥物。當(dāng)然,在后期的試驗(yàn)中,將在結(jié)構(gòu)表征的基礎(chǔ)上,通過(guò)細(xì)胞模型和動(dòng)物模型對(duì) EPS的體內(nèi)外抗氧化活性做深入研究,以探究其構(gòu)效關(guān)系,以為其開發(fā)利用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 Finkel T,Holbrook NJ.Oxidants,oxidative stress and the biology of aging.Nature,2000,408:239-247.

2 Guzy RD,HoyosB,Robin E,et al.Mitochondrial complex III is required for hypoxia-induced ROS production and cellular oxygen sensing.CellM etab,2005,1:401– 408.

3 Fu JJ,Huang HQ,Liu JJ,et al.Tanshinone I IA protects cardiac myocytes against oxidative stress-triggered damage and apoptosis.Eur J Phar m acol,2007,568:213– 221.

4 Angeloni C,Spencer JPE,Leoncini E,et al.Role of quercetin and its in vivo metabolites in protecting H9c2 cells against oxidative stress.B iochim ie,2007,89:73– 82.

5 Bognar Z,Kalai T,Palfi A,et al.A novel SOD– mimetic per meability transition inhibitor agent protects ischemic heart by inhibiting both apoptotic and necrotic cell death.Free RadicalB iolM ed,2006,41:835– 848.

6 Sun C,Shan CY,Gao XD,et al.Protection of PC12 cells from hydrogen peroxide-induced injury by EPS2,an exopolysaccharide from a marine filamentous fungusKeissleriellasp. YS4108.J B iotechnol,2005,115:137-144.

7 Chen H,Yan X,Zhu P,et al.Antioxidant activity and hepatoprotective potential of agaro-oligosaccharides in vitro and in vivo.Nutr J,2006,5:31-41.

8 Looijestenijn PJ,Boels IC,Kleerebezem M,et al.Regulation of exopolysaccharide production byLactococcus lactissubsp. cremorisby the sugar source.Appl Environ M icrobiol,1999, 65:5003-5008.

9 Levander F,Radstrom P.Requirement for phosphoglucomutase in exopolysaccharide biosynthesis in glucose and lactose utilizingStreptococcus ther m ophilus.Appl Environ M icrobiol,2001,67:2734– 2738.

10 Zeng KH(曾凱宏),Ming J(明建),Zeng KF(曾凱芳). Structure and Function of Fungi Polysaccharides.Food Sci Technol(食品科技),2001,37:66-68

11 Yang ZN,Huttunen E,StaafM,et al.Separation,purification and characterization of extracellular polysaccharides produced by sl ime-for ming,actococcuslactisssp.cremoris strains.IntDairy J,1999,9:631-638.

12 He S Y(何書英),Zhan T(詹彤),Wang S R(王淑如). Study on Chemistry and Antioxidant Activity ofWater Soluble PolysaccharidesofRhizom a D ioscoreaeOppositae.J China Phar maceut Univ(中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)),1994,25:369-371.

13 Ran L(冉靚),Yang XS(楊小生),Wang BC(王伯初),et al.Progress in Studies of Antioxidant Polysaccharides.Lishizhen M ed M atM ed Res(李時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥),2006,17:494-496.

14 Wang HY,Jiang XL,Mu HJ.Structure and protective effect of exopolysaccharide fromP.Agglom eransstrain KFS-9 againstUV radiation.M icrobiol Res,2007,162:124-129.

Antioxidative Activity of Exopolysaccharide Produced byEnterobacter cloacaeZ0206

XU Chun-lan,Q IN Chuan-guang＊,N IU Wei-ning,SHANG Xiao-ya
Faculty of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University,Xi’an 710072,China

The experiment was conducted to prepare exopolysaccharide(EPS)fromEnterobacter cloacaeZ0206 strain through fermentation and to evaluate its antioxidant activity.By determining the reducing capability,the scavenging effects of EPS on 1,1-diphenyl-2-picrylhy-drazyl(DPPH)radicals,superoxide anion free radicals,and hydroxyl radicals,the antioxidant activity of EPSwere evaluated.The results showed that the yield of EPSwas 6.62 g/L and the scavenging effects of EPSon theDPPH free radical and the hydroxyl radicals reached 61.57%and 40.08%at concentration of 5 mg/mL,respectively.The EPS exhibited obvious antioxidant activity and wasworthy of exploitation in future.

Enterobacter cloacae;exopolysaccharide;free radicals;antioxidant

1001-6880(2010)06-1098-05

2009-06-30 接受日期:2009-08-24

中國(guó)博士后科學(xué)基金 (20080440195)和西北工業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(2008KJ02040)。

＊通訊作者 Tel:86-29-88491840,E-mail:lx304319@163.com

TS201.2

A