丹酚酸B對高脂日糧小鼠抗氧化與淋巴細(xì)胞亞群免疫功能調(diào)節(jié)的研究

王 斌,崔 玨,肖 瀛,施用暉1,,樂國偉1,＊1江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室;江南大學(xué)食品學(xué)院食品營養(yǎng)與安全研究所,無錫 141

丹酚酸B對高脂日糧小鼠抗氧化與淋巴細(xì)胞亞群免疫功能調(diào)節(jié)的研究

王 斌2,崔 玨2,肖 瀛2,施用暉1,2,樂國偉1,2＊1江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室;2江南大學(xué)食品學(xué)院食品營養(yǎng)與安全研究所,無錫 214122

本文研究了丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)對飼喂高脂日糧小鼠抗氧化及淋巴細(xì)胞亞群免疫功能調(diào)節(jié)的影響。選取 4 w齡雄性 C57BL/6小鼠 40只,隨機(jī)平均分成 4組:即正常對照組 (正常日糧),高脂日糧組(高脂日糧),SalB低劑量組(高脂日糧 +0.002%SalB)和 SalB高劑量組 (高脂日糧 +0.004%SalB)。八周后測定血脂、全血和脾臟活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、抗氧化酶活性及MDA含量;采用 FACSAria流式細(xì)胞儀分析小鼠外周血及脾臟淋巴細(xì)胞亞群。結(jié)果表明:SalB可顯著降低高脂日糧小鼠血脂水平,全血及脾臟 ROS水平,提高抗氧化能力,提高 CD4+/CD8+T細(xì)胞比例及 CD19+細(xì)胞百分率(P<0.05)。低劑量 SalB組抗氧化與免疫調(diào)節(jié)功能好于高劑量 SalB組。

高脂日糧;丹酚酸B;血脂;活性氧;抗氧化酶;淋巴細(xì)胞亞群

長期高脂的攝入可導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力的顯著降低,引起機(jī)體氧化應(yīng)激[1],機(jī)體抗氧化能力的顯著降低預(yù)示著體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡已被打破,大量自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可以引起脂質(zhì)過氧化、DNA和蛋白質(zhì)的氧化損傷[2,3],破壞免疫細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能,影響免疫調(diào)節(jié)功能[4]。丹酚酸B(Salvianolic acid B)是丹參中重要的水溶性有效活性成分之一,其主要在降低血脂、抗氧化、減輕炎癥損傷及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能等方面發(fā)揮重要作用[5,6]。但 SalB對機(jī)體氧化應(yīng)激和免疫功能紊亂的調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。

本實驗以高脂日糧長期飼喂小鼠,建立氧化應(yīng)激模型,研究 Sal B對長期攝食高脂日糧小鼠清除過量 ROS的抗氧化作用與淋巴細(xì)胞亞群免疫功能調(diào)節(jié)的影響。探討 SalB抗氧化活性與淋巴細(xì)胞亞群免疫調(diào)節(jié)功能之間的關(guān)系,從而為營養(yǎng)性氧化應(yīng)激引發(fā)機(jī)體免疫功能損傷疾病提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

魯米諾(Luminol,生物級,蘇州亞科化學(xué)試劑有限公司);辣根過氧化物酶 (Horseradish peroxidase, HRP,250 U/mg,北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司);丹酚酸 B(純度 78%,西安鴻生生物技術(shù)有限公司);單抗試劑:FITC anti-mouse CD4(L3T4)(克隆號:GK 1.5);PE anti-mouse CD8a(Ly-2)(克隆號: 53-6.7);PE-Cy5 anti-mouse CD3e(克隆號:145-2C11);PE anti-mouse CD19(克隆號:MB 19-1)(美國 eBioscience公司);流式細(xì)胞檢測劑 (深圳晶美生物工程有限公司);EZ-SepμMouse 1X淋巴細(xì)胞分離液(深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 儀器

MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測試系統(tǒng) (西安瑞邁分析儀器有限公司);UV1100型紫外可見分光光度計 (北京瑞利科學(xué)儀器有限公司);Multiskan Mk3酶標(biāo)儀 (美國 Ther mo公司);FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.1.3 動物

4周齡雄性 C57BL/6小鼠,清潔級,體重 10～14 g,由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計

選用 4周齡雄性健康 C57BL/6小鼠 40只,一周預(yù)飼后,按體重隨機(jī)分成 4組:即正常對照組 (正常日糧),高脂模型組 (高脂日糧),低劑量 Sal B組(高脂日糧 +0.002%SalB)和高劑量 SalB組(高脂日糧 +0.004%Sal B),其中 Sal B混合于高脂日糧中,自由采食。日糧配方見表 1。飼養(yǎng) 8周后,各組小鼠隔夜禁食 12 h,摘眼球取血,肝素抗凝,取一部分全血測完 ROS和淋巴細(xì)胞亞群后,剩余全血低速離心(3000 r/min離心 15 min),取上層抗凝血漿用于血脂、抗氧化酶活性和MDA含量檢測。斷頸椎處死小鼠,無菌取出脾臟,一部分用于脾臟淋巴細(xì)胞亞群的檢測,剩余部分制成 10%組織勻漿,取一部分脾臟組織勻漿檢測 ROS,剩余脾臟勻漿液 4000 r/ min離心 10 min,取脾臟勻漿上清液用于抗氧化酶活性和MDA含量的檢測。

表 1 實驗日糧配方及營養(yǎng)組成(%)Table 1 Formula and nutrients content of the diet(%)

1.2.2 血脂代謝指標(biāo)的檢測

血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯 (TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)含量的測定均按中生北控生物科技股份有限公司試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.3 全血及脾臟中 ROS水平的測定

參照 luminol化學(xué)發(fā)光法[7-9]測定,新鮮抗凝血15μL稀釋于 865μL Hepes(pH 7.4)緩沖液中 (或10%脾臟組織勻漿 50μL稀釋于 830μL HEPES緩沖液),加入 20μL HRP(12.4 U/mL)作為催化劑,混勻反應(yīng)體系,ROS水平使用MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測,啟動發(fā)光后注射 100μL luminol(5 mmol/mL)于反應(yīng)瓶中,以發(fā)光強(qiáng)度表示ROS水平的高低。

1.2.4 抗氧化酶活性及MDA含量檢測

超氧化物岐化酶(SOD)采用鄰苯三酚自氧化法測定[10];過氧化氫酶 (CAT)、總抗氧化能力 (TAOC)和丙二醛(MDA)按南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.5 外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測

小鼠眼球取血后,每個樣本取 200μL抗凝全血平均加入到 2個上樣管中,避光分別標(biāo)記 CD單抗(按試劑說明書加量),混勻,室溫避光孵育 30 min后每管加入 1＊流式細(xì)胞檢測劑 2 mL充分混勻,室溫避光孵育 10 min,1000 r/min,5 min離心去上清, PBS洗 2次細(xì)胞,0.5 mL PBS重懸細(xì)胞,振蕩混勻后上機(jī)檢測外周血淋巴細(xì)胞 CD3+,CD3+CD4+, CD3+CD8+和 CD19+的細(xì)胞百分含量。

1.2.6 脾臟淋巴細(xì)胞亞群的檢測

無菌取小鼠新鮮脾臟于不銹鋼網(wǎng)上剪碎,加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液,用注射器活塞研磨,制備脾細(xì)胞懸液后,加入 1 mL RPM I1640培養(yǎng)基,3000 r/ min離心 30 min,吸出淋巴細(xì)胞層,加入 10 mL 1640培養(yǎng)基洗滌一次,2500 r/min離心 10 min,去上清, PBS重懸,細(xì)胞計數(shù)。每個樣本取 200μL單細(xì)胞懸液平均加入到 2個上樣管中,避光分別標(biāo)記 CD單抗 (按試劑說明書加量),振蕩混勻,室溫避光孵育30 min,PBS洗 2次,加入 0.5 mL PBS重懸細(xì)胞,振蕩混勻后上機(jī)檢測脾臟淋巴細(xì)胞 CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+和 CD19+的細(xì)胞百分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法

利用 CELLQuest軟件分析流式細(xì)胞儀上獲取的數(shù)據(jù)。采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析和 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 SalB對高脂日糧小鼠血脂代謝的影響

表 2 SalB對高脂日糧小鼠血脂代謝的影響(mmol/L,±s,n=10)Table 2 Effects of SalB on the plasma lipid status in high-fat diet fed mice(mmol/L,±s,n=10)

表 2 SalB對高脂日糧小鼠血脂代謝的影響(mmol/L,±s,n=10)Table 2 Effects of SalB on the plasma lipid status in high-fat diet fed mice(mmol/L,±s,n=10)

注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05),下表同。Note:Valueswith different superscript letterswith in a row are significantly different(P<0.05).The same as below.

組別Group 甘油三脂TG總膽固醇TC低密度脂蛋白膽固醇LDL-C高密度脂蛋白膽固醇HDL-C對照組Control 0.78±0.09d 2.91±0.12c 0.94±0.11c 0.91±0.07a高脂組HFD 1.50±0.11a 4.05±0.40a 1.74±0.04a 0.56±0.07c高脂 +0.002%SalB HFD+0.002%SalB 0.87±0.07c 3.08±0.18bc 0.97±0.09c 0.90±0.03a高脂 +0.004%SalB HFD+0.004%SalB 1.03±0.09b 3.17±0.16b 1.10±0.11b 0.82±0.11b

由表 2可見,與正常日糧組相比,高脂日糧組小鼠血漿 TG、TC、LDL-C含量顯著增高,HDL-C含量顯著降低 (P<0.05)。添加低劑量的 Sal B (0.002%)可顯著降低高脂日糧小鼠血漿 TG、TC、LDL-C含量,顯著升高 HDL-C含量 (P<0.05),且低劑量 SalB(0.002%)組小鼠 TC、LDL-C和HDL-C含量與正常日糧組無顯著性差異(P>0.05)。高劑量 SalB(0.004%)組小鼠 TG、TC、LDL-C含量較高脂日糧組有所降低,HDL-C較高脂日糧組有所升高,但其 TG和 LDL-C含量顯著高于低劑量 Sal B (0.002%)組 (P<0.05),HDL-C含量顯著低于低劑量 SalB(0.002%)組(P<0.05)。

2.2 SalB對高脂日糧小鼠全血與脾臟 ROS水平的影響

由圖 1可見,與正常日糧組相比,高脂日糧組小鼠全血 ROS水平顯著增高 (P<0.05)。添加低劑量的 SalB(0.002%)可顯著降低高脂日糧小鼠全血ROS水平(P<0.05),高劑量 Sal B(0.004%)組與高脂日糧組水平無明顯差異(P>0.05)。

高脂日糧使小鼠脾臟 ROS水平顯著提高 (P< 0.05)。SalB的添加可顯著降低高脂日糧小鼠脾臟ROS水平(P<0.05),低劑量 Sal B(0.002%)組脾臟 ROS水平低于高劑量 Sal B(0.004%)組 (P> 0.05)。

圖 1 SalB對高脂日糧小鼠全血、脾臟 ROS水平的影響(mmol/L,±s,n=10)Fig.1 Effects of SalB on the ROS of blood and spleen in high-fat diet fed mice(mmol/L,±s,n=10)

2.3 SalB對高脂日糧小鼠血漿抗氧化酶活性及MDA含量的影響

表 3 SalB對高脂日糧小鼠血漿抗氧化酶活性及MDA含量的影響(±s,n=10)Table 3 Effects of SalB on the antioxidase activity and the content ofMDA in blood plasma of high-fat diet fed mice(±s,n=10)

表 3 SalB對高脂日糧小鼠血漿抗氧化酶活性及MDA含量的影響(±s,n=10)Table 3 Effects of SalB on the antioxidase activity and the content ofMDA in blood plasma of high-fat diet fed mice(±s,n=10)

組別Group T-AOC(U/mL) CAT(U/mL) SOD(U/mL) MDA(nmol/mL)對照組Control 5.27±0.44a 27.21±3.43a 2.48±0.18a 25.20±2.25c高脂組HFD 4.32±0.22b 17.80±3.14b 1.45±0.21c 37.61±3.16a高脂 +0.002%SalB HFD+0.002%SalB 5.04±0.40a 24.67±3.32a 2.19±0.22b 26.85±2.63c高脂 +0.004%SalB HFD+0.004%SalB 4.58±0.34b 19.33±2.25b 1.62±0.15c 29.82±2.32b

由表 3可知,與正常日糧組相比,高脂日糧組小鼠血漿 CAT、SOD及總抗氧化能力顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.05)。在高脂日糧基礎(chǔ)上添加低劑量 Sal B(0.002%)顯著提高小鼠血漿 CAT、SOD及總抗氧化能力 (P<0.05),高劑量 Sal B (0.004%)組與高脂日糧組相比,血漿 CAT、SOD及總抗氧化能力水平無明顯差異 (P>0.05)。高、低劑量 SalB組均可顯著降低高脂日糧小鼠血漿MDA含量(P<0.05),且低劑量 Sal B(0.002%)組MDA水平低于高劑量 SalB(0.004%)組 (P<0.05)。

2.4 SalB對高脂日糧小鼠脾臟抗氧化酶活性及MDA含量的影響

表 4 SalB對高脂日糧小鼠脾臟抗氧化酶活性及MDA含量的影響(±s,n=10)Table 4 Effects of SalB on the actioxidase activity and the content ofMDA in spleen of high-fat diet fed mice(±s,n=10)

表 4 SalB對高脂日糧小鼠脾臟抗氧化酶活性及MDA含量的影響(±s,n=10)Table 4 Effects of SalB on the actioxidase activity and the content ofMDA in spleen of high-fat diet fed mice(±s,n=10)

組別Group T-AOC(U/mg prot) CAT(U/mg prot) SOD(U/mg prot) MDA(nmol/mg prot)對照組Control 0.29±0.04a 5.34±0.36a 30.39.±4.25a 2.61±0.28c高脂組HFD 0.15±0.03c 4.34.±0.33b 22.79.±5.92b 3.55±0.36a高脂 +0.002%SalB HFD+0.002%SalB 0.27±0.04a 5.12±0.63a 29.44.±4.73a 2.83±0.42bc高脂 +0.004%SalB HFD+0.004%SalB 0.20±0.04b 4.58±0.58b 27.86±5.53ab 3.16±0.46ab

與正常日糧組相比,高脂日糧組小鼠脾臟CAT、SOD及總抗氧化能力顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.05)。在高脂日糧基礎(chǔ)上添加低劑量SalB(0.002%)顯著提高小鼠脾臟 CAT、SOD及總抗氧化能力,降低MDA含量(P<0.05)。添加高劑量 SalB(0.004%)可顯著提高高脂日糧小鼠總抗氧化能力(P<0.05),而 CAT、SOD及MDA水平與高脂日糧組相比無明顯差異(P>0.05),見表 4。

2.5 SalB對高脂日糧小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響

高脂日糧組與正常日糧組比較,小鼠外周血中CD3+CD4+細(xì)胞百分率降低,而 CD3+CD8+細(xì)胞百分率顯著升高 (P<0.05),CD3+CD4+與 CD3+CD8+比值顯著低于正常日糧組 (P<0.05)(表 5)。在高脂日糧基礎(chǔ)上添加高、低劑量 Sal B均能顯著提高高脂日糧小鼠 CD3+CD4+細(xì)胞百分率 (P< 0.05),低劑量 Sal B(0.002%)組 CD3+CD4+與CD3+CD8+比值和正常日糧組無明顯差異 (P> 0.05)。高脂日糧使 CD19+細(xì)胞百分率顯著降低(P <0.05),高、低劑量 Sal B均能顯著提高高脂日糧小鼠 CD19+細(xì)胞百分率 (P<0.05),低劑量 Sal B (0.002%)組 CD19+細(xì)胞百分率與正常日糧組無明顯差異(P>0.05)。

表 5 SalB對高脂日糧小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響(±s,n=10)Table 5 Effects of SalB on the lymphocyte subsets of peripheral blood in high-fat diet fed mice(±s,n=10)

表 5 SalB對高脂日糧小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響(±s,n=10)Table 5 Effects of SalB on the lymphocyte subsets of peripheral blood in high-fat diet fed mice(±s,n=10)

組別Group CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%) CD4+/CD8+ CD19+(%)對照組Control 14.65±1.34a 9.87±1.04b 1.49±0.17a 49.26±2.78a高脂組HFD 10.41±0.82c 11.46±0.89a 0.91±0.10b 34.59±3.38c高脂 +0.002%SalB HFD+0.002%SalB 15.72±1.29a 10.16±0.99b 1.56±0.20a 48.92±4.10a高脂 +0.004%SalB HFD+0.004%SalB 12.55±2.51b 12.16±1.10a 1.02±0.12b 44.99±3.54b

2.6 SalB對高脂日糧小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群的影響

高脂日糧組與正常日糧組相比,小鼠脾臟中CD3+CD4+細(xì)胞百分率降低,而 CD3+CD8+細(xì)胞百分率顯著升高 (P<0.05)。CD3+CD4+與 CD3+CD8+比值顯著低于正常日糧組 (P<0.05)(見表6)。低劑量 SalB(0.002%)組能夠顯著降低 CD3+CD8+細(xì)胞百分率,提高 CD3+CD4+與 CD3+CD8+比值(P<0.05),高劑量 Sal B(0.004%)組 CD3+CD4+與 CD3+CD8+比值與高脂日糧組無明顯差異(P>0.05)。高脂日糧使小鼠脾臟 CD19+細(xì)胞百分率顯著降低(P<0.05),在高脂日糧中添加高、低劑量 SalB均能顯著提高小鼠脾臟中 CD19+細(xì)胞百分率 (P<0.05),低劑量 Sal B(0.002%)組 CD19+細(xì)胞百分率高于高劑量 Sal B(0.004%)組 (P< 0.05)。

表 6 SalB對高脂日糧小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群的影響 (±s,n=10)Table 6 Effects of SalB on the lymphocyte subsets of spleen in high-fat diet fed mice(±s,n=10)

表 6 SalB對高脂日糧小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群的影響 (±s,n=10)Table 6 Effects of SalB on the lymphocyte subsets of spleen in high-fat diet fed mice(±s,n=10)

組別Group CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%) CD4+/CD8+ CD19+(%)對照組Control 13.12±0.84a 4.59±0.60b 2.88±0.26a 74.95±4.03a高脂組HFD 11.02±0.83b 8.16±1.09a 1.38±0.27c 59.15±2.42d高脂 +0.002%SalB HFD+0.002%SalB 11.12±1.53b 4.74±0.63b 2.35±0.15b 70.07±3.76b高脂 +0.004%SalB HFD+0.004%SalB 10.77±0.80b 7.58±0.73a 1.43±0.20c 63.93±2.52c

2.7 相關(guān)性分析

對小鼠血漿、脾臟抗氧化能力與淋巴細(xì)胞亞群做相關(guān)性分析顯示:小鼠血漿、脾臟淋巴細(xì)胞 CD3+CD4+與 CD3+CD8+比值、CD19+細(xì)胞百分率與活性氧自由基水平成顯著負(fù)相關(guān) (P<0.01),與抗氧化能力成顯著正相關(guān)(P<0.01),見表 7。

表 7 小鼠血漿、脾臟抗氧化酶活性及MDA含量與淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)性分析Table 7 The correlation between the antioxidase activity,the content ofMDA and lymphocyte subsets in blood and spleen ofmice

注:＊表示相關(guān)性顯著 (P<0.05),＊＊表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)。Note:＊Correlation is at the 0.05 level(2-tailed),＊＊Correlation is at the 0.01 level.

3 討論

3.1 丹酚酸B對高脂日糧小鼠血脂代謝的影響

長期高脂膳食引起機(jī)體血脂代謝異常,血液中膽固醇或甘油三酯的含量過高,造成高脂血癥,導(dǎo)致機(jī)體LDL-C含量升高,同時降低HDL-C的含量。而高水平的LDL-C和低水平的 HDL-C是引起動脈粥樣硬化 (atherosclerosis,AS)的重要誘因[11],其可引起機(jī)體氧化與抗氧化狀態(tài)失衡。本實驗高脂日糧組小鼠血漿 TG、TC、LDL-C的含量顯著升高,HDL-C含量顯著降低,造成小鼠高血脂和氧化應(yīng)激。Sal B的添加可顯著降低高脂日糧小鼠血漿 TG、TC、LDLC含量,顯著升高 HDL-C含量,低劑量 Sal B (0.002%)組小鼠 TG和LDL-C含量顯著低于高劑量 SalB(0.004%)組,HDL-C含量顯著高于高劑量SalB(0.004%)組。說明 Sal B的添加可以改善高脂日糧小鼠的血脂代謝紊亂,并且低劑量 Sal B (0.002%)的添加對高脂日糧小鼠降血脂效果好于高劑量 SalB(0.004%)。

3.2 丹酚酸B對高脂日糧小鼠全血和脾臟 ROS水平的影響

長期高脂膳食可引起自由基代謝紊亂,當(dāng)血脂升高時,過多脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)皮,使內(nèi)皮產(chǎn)生的抗氧化酶含量下降,機(jī)體清除自由基的能力下降,產(chǎn)生大量自由基。在生物體系中,自由基及其誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)均可對機(jī)體產(chǎn)生一系列有害影響,損害細(xì)胞,導(dǎo)致多種病理過程[1,2]?？寡趸瘎┩ㄟ^及時地清除體內(nèi)過量的自由基,抵抗脂質(zhì)過氧化,從而緩解自由基導(dǎo)致的氧化損傷。高脂日糧組小鼠全血、脾臟中 ROS水平較正常日糧組顯著升高 (P< 0.05)。SalB的添加可降低高脂日糧小鼠全血及脾臟 ROS水平,且低劑量 SalB(0.002%)組與正常日糧組無明顯差異(P>0.05),表明 SalB可以有效清除高脂日糧中大量產(chǎn)生的 ROS,并且低劑量 Sal B (0.002%)組清除 ROS作用好于高劑量 Sal B (0.004%)組。

3.3 丹酚酸B對高脂日糧小鼠血漿和脾臟抗氧化酶活性及MDA含量的影響

生物體本身有一系列清除自由基的抗氧化酶,如 CAT、SOD可以清除過多的 H2O2、O2-,有效降低·OH,從而減輕自由基的氧化損傷,總抗氧化能力是對機(jī)體非酶性抗氧化能力的綜合評價指標(biāo)。由本實驗可知,高脂日糧組小鼠血漿和脾臟中 SOD、CAT抗氧化酶活性顯著下降,總抗氧化能力顯著降低。氧自由基不僅通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細(xì)胞損傷,而且還通過脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷,因而MDA的量反映了機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度,從而間接反映出細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本實驗中高脂日糧組小鼠血漿和脾臟中MDA含量顯著高于對照組,血漿與脾臟受到ROS的氧化損傷。

體內(nèi)外實驗研究表明,SalB通過恢復(fù)損傷細(xì)胞的抗氧化酶活力,保護(hù) H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞的氧化性損傷,并對脂質(zhì)過氧化有很強(qiáng)的抑制作用[12]。本實驗可知,高脂日糧使小鼠血漿和脾臟抗氧化酶活力和總抗氧化能力降低,MDA含量升高,這與高脂日糧使小鼠血脂水平升高相對應(yīng),進(jìn)一步證實氧化應(yīng)激/脂質(zhì)過氧化確實參與了高脂膳食誘發(fā)的血脂代謝紊亂的發(fā)生、發(fā)展。在高脂日糧中添加低劑量SalB(0.002%)可有效恢復(fù)高脂日糧小鼠血漿和脾臟抗氧化酶活力,提高總抗氧化能力,降低高脂日糧小鼠血漿和脾臟 MDA含量。高劑量 Sal B (0.004%)的添加不能有效恢復(fù)高脂日糧小鼠的抗氧化能力。實驗結(jié)果表明一定劑量的 Sal B可通過提高抗氧化酶活力,減少脂質(zhì)過氧化,從而緩解高脂日糧造成的氧化損傷,并且低劑量 Sal B(0.002%)的添加對高脂日糧小鼠氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用好于高劑量 SalB(0.004%)。

3.4 丹酚酸B對高脂日糧小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞亞群免疫功能的影響

機(jī)體生命代謝過程中產(chǎn)生大量有害的 ROS,這些 ROS在體內(nèi)的累積可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),大大損害機(jī)體的免疫系統(tǒng)[13,14]。研究顯示,氧化應(yīng)激狀態(tài)下,大量 ROS可以下行性調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的抗原遞呈作用,抑制 T淋巴細(xì)胞的活性[15]。

參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞主要有兩類,即 T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞是體內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞成分,并對B淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白的過程進(jìn)行調(diào)控。T細(xì)胞按其 CD4和 CD8表面標(biāo)志可區(qū)分為 CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞兩個亞群。T細(xì)胞亞群的數(shù)目和 CD4+/CD8+T細(xì)胞的比例,是判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)的一項重要指標(biāo)。CD19+分布于除漿細(xì)胞外的 B細(xì)胞譜系發(fā)育的各個階段,是B細(xì)胞的重要標(biāo)記,反映體液免疫的水平。

本文研究發(fā)現(xiàn),高脂日糧使小鼠外周血和脾臟CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值偏離正常日糧水平,提示高脂日糧小鼠 T淋巴細(xì)胞免疫功能異常。低劑量的 SalB(0.002%)的添加能通過增加CD4+T細(xì)胞、降低 CD8+T細(xì)胞,從而提高高脂日糧小鼠 CD4+/ CD8+T細(xì)胞的比值,協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的相互作用。高劑量的 Sal B(0.004%)組小鼠 CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值與高脂日糧組無顯著性差異,不能有效地改善高脂日糧小鼠 T淋巴細(xì)胞免疫功能異常。Sal B的添加能有效提高小鼠外周血和脾臟 CD19+細(xì)胞比例,說明它對高脂日糧小鼠體液免疫功能低下有較好的改善作用。低劑量 Sal B(0.002%)組CD19+細(xì)胞水平高于高劑量 Sal B(0.004%)組,說明低劑量 SalB(0.002%)的添加對高脂日糧小鼠體液免疫功能低下的調(diào)節(jié)作用好于高劑量 Sal B (0.004%)。綜上所述,高脂日糧造成小鼠淋巴細(xì)胞亞群免疫功能失調(diào),低劑量 Sal B(0.002%)的添加可以改善高脂日糧誘導(dǎo)的小鼠免疫功能損傷,并且其作用效果好于高劑量的 SalB(0.004%)。

3.5 丹酚酸B改善高脂日糧小鼠氧化應(yīng)激與免疫功能損傷的最適添加劑量

高脂膳食可引起機(jī)體血脂代謝紊亂,誘發(fā)糖尿病、動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、心腦血管疾病、腎病綜合癥和癌癥等一系列疾病的發(fā)生,而高脂血癥和動脈粥樣硬化等疾病的形成是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程,從而造成機(jī)體的免疫功能損傷。因此預(yù)防高脂膳食引起的免疫損傷是維持機(jī)體平衡、調(diào)節(jié)免疫功能紊亂的重要措施。由本實驗結(jié)果可知,高脂日糧造成小鼠機(jī)體 ROS水平升高,誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激,導(dǎo)致外周血和脾臟淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量異常和平衡失調(diào),機(jī)體免疫功能受損。相關(guān)性分析顯示,抗氧化能力與淋巴細(xì)胞亞群密切相關(guān),Sal B作為一種天然抗氧化劑能夠緩解高脂日糧對小鼠免疫功能的損傷,其影響趨勢與其抗氧化活性一致,其原因可能是 Sal B通過清除 ROS,提高機(jī)體抗氧化酶活力,緩解高脂日糧對免疫細(xì)胞的氧化損傷,調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群分布,從而改善機(jī)體免疫功能。同時這也為營養(yǎng)性氧化應(yīng)激引發(fā)機(jī)體免疫功能損傷疾病提供新的解決方案。

本實驗中,低劑量 Sal B(0.002%)的降低血脂作用好于高劑量 SalB(0.004%)組,并且低劑量 Sal B的添加使高脂日糧小鼠 ROS水平、抗氧化酶活力、MDA含量和外周血淋巴細(xì)胞亞群分布恢復(fù)到正常日糧小鼠水平,而高劑量 SalB(0.004%)的添加,不能有效地改善高脂日糧小鼠的氧化應(yīng)激和免疫功能損傷。在肝細(xì)胞培養(yǎng)中,添加適量的硫辛酸能夠降低自由基水平,而高劑量時 ROS水平增高,如同脂溶性維生素VE一樣,水溶性的丹酚酸 B過量使用也會導(dǎo)致自由基增加,影響機(jī)體抗氧化能力。0.002%SalB是抗氧化與免疫調(diào)節(jié)作用的適宜添加劑量。另外,SalB對高脂日糧小鼠免疫功能調(diào)節(jié)的作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

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Antioxidation and Immunomodulatory function on Lymphocyte Subsets of Salvianolic Acid B in High-fatD iet FedM ouse

WANG Bin2,CU IJue2,XIAO Ying2,SH I Yong-hui1,2,LE Guo-wei1,2＊1State key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,W uxi 214122,China;2Institute of Nutrition and Food Safety,School of Food Science and Technology,Jiangnan University,W uxi 214122,China

This article illustrates the effects of Salvianolic acid B(Sal B)on the antioxidation and immunomodulatory function of lymphocyte subsets in high-fat diet fed mouse.Forty male C57BL/6 mice were randomly assigned to four groups.The control group consumed an ordinary diet.The other three experimental groupswere fed with a high-fat diet, a high-fat diet plus 0.002%SalB,and a high-fat diet plus 0.004%SalB,respectively.After 8 weeks,the plasma lipid status,reactive oxygen species(ROS)level,actioxidase activity and the contentofMDA in blood and spleenwere examined.The proportion of lymphocyte subsets were deter mined by FACSAria Flow Cytometer.The results indicated that supplementation of SalB could decrease the levels of plasma lipid and ROS and increase the antioxidation index of highfat dietmice.It could increase the ratio of CD4+and CD8+T cell as well as the ratio of CD19+cell in experimental groups.The antioxidation and immunoregulation effects of low dose of SalB were better than those of the high dose.

high-fat diet;Salvianolic acid B;plas ma lipid;reactive oxygen species;antioxidase;lymphocyte subsets

1001-6880(2010)06-0965-08

2009-02-25 接受日期:2009-05-06

國家自然基金(30571347);科技部十一五支撐計劃項目(2006BAD27B06)

＊通訊作者 Tel:86-510-85917789;E-mail:lgw@jiangnan.edu.cn

R285.5;Q946.91

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