PARP-1 mRNA表達(dá)在急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷中的作用

余佳 王衛(wèi)星 徐勝 鄧文宏 陳曉燕 崔周軍 陳辰

·短篇論著·

PARP-1 mRNA表達(dá)在急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷中的作用

余佳 王衛(wèi)星 徐勝 鄧文宏 陳曉燕 崔周軍 陳辰

急性胰腺炎肺損傷(acute pancreatitis associated-lung injury，APALI)是重癥急性胰腺炎(SAP)最常見(jiàn)胰外并發(fā)癥，也是SAP患者早期病死的主要原因[1]，其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明。研究表明，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)在眾多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮廣泛的生理作用，與多種炎癥疾病如膿毒癥、胰腺炎并發(fā)的多器官功能障礙等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-4]。本實(shí)驗(yàn)觀察PARP-1 mRNA在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織中的表達(dá)，并探討其在肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：SPF級(jí)6～7周齡雄性Wistar大鼠32只，體重200～240 g，購(gòu)自湖北省疾病控制中心。按數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組及ANP 3、6、12 h組，每組8只。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c(美國(guó)Sigma公司)1 ml/kg體重方法制備ANP模型。假手術(shù)組開(kāi)腹后僅翻動(dòng)十二指腸和胰腺即關(guān)腹。

2．標(biāo)本采集和檢測(cè)指標(biāo)：術(shù)后3、6、12 h分批處死大鼠，心臟采血，分離血清，以全自動(dòng)生化分析儀采用酶顯色法測(cè)定血清淀粉酶水平。取胰腺頭部和右肺下葉經(jīng)4%多聚甲醛固定后，包埋、切片、HE染色，由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法在光鏡下觀察胰腺及肺組織病理學(xué)改變并評(píng)分。胰腺病理評(píng)分參照Schmidt法[5]；肺組織病理評(píng)分參照Osman法[6]。取右肺中葉，以吸水紙拭去表面血跡和水分，稱(chēng)濕重后85℃烘烤48 h再稱(chēng)重，計(jì)算肺組織的濕/干比。其余肺組織經(jīng)液氮固定，-80℃凍存。取約80 mg肺組織，用Trizol提取總RNA。采用RT-PCR方法測(cè)定肺組織PARP-1mRNA表達(dá)。PARP-1(442 bp)上游5′-ACGCACAATGCCTATGAC-3′，下游5′-CCAGCGGAACCTCTACAC-3′；β-actin(207 bp)上游5′-CCAACTGGGACGATATGGAG-3′，下游5′-CAGAGGCATACAGGGACAAC-3′，引物由Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、53.7℃(PARP)或54℃(β-actin)30 s、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，應(yīng)用圖像分析儀掃描，以PARP-1與β-actin條帶光密度比值表示PARP-1 mRNA的表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．一般情況：造模后ANP組大鼠精神和活動(dòng)度變差，蜷縮，煩渴，毛色不勻齊且光澤晦暗。12 h時(shí)死亡1只(12.5%)。

2．血清淀粉酶的變化：假手術(shù)組和ANP 3、6、12 h組的血清淀粉酶水平分別為(1179±3235)U/L、(3864±529)U/L、(4876±805)U/L、(6532±1050)U/L，呈時(shí)間依賴(lài)性明顯升高(P<0.05)。

3．胰腺組織病理改變：ANP組胰腺有不同程度的水腫、出血及片狀壞死，腺葉間隙增寬和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。假手術(shù)組和ANP 3、6、12 h組的胰腺病理評(píng)分分別為0.28±0.05、6.38±0.76、8.73±0.55、11.4±1.13，呈時(shí)間依賴(lài)性明顯升高(P<0.05)。

4．肺組織病理改變及濕/干比的變化：ANP 3 h組肺組織充血、出血、間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；6 h組肺泡腔內(nèi)滲出液增多，部分肺泡萎縮或形成肺大泡，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加；12 h組可見(jiàn)出血和大片實(shí)變(圖1)。假手術(shù)組和ANP 3、6、12 h組的肺組織病理評(píng)分分別為0.22±0.02、1.21±0.11、1.72±0.14、2.2±0.35；濕/干比分別為1.77±0.23、2.05±0.12、2.43±0.14和2.97±0.36，均呈時(shí)間依賴(lài)性明顯升高(P<0.05)。

圖1假手術(shù)組(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)組肺組織的病理改變(HE ×200)

5．肺組織PARP-1 mRNA表達(dá)的變化：假手術(shù)組和ANP 3、6、12 h組肺組織PARP-1 mRNA表達(dá)量分別為0.13±0.04、0.25±0.07、0.37±0.11、0.51±0.14(圖2)，呈時(shí)間依賴(lài)性升高(P<0.05)。肺組織PARP-1 mRNA表達(dá)與胰腺組織病理評(píng)分、肺組織病理評(píng)分均存在正相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為0.943、0.963(P<0.05)。

圖2假手術(shù)組(1，5)和ANP 3(2，6)、6(3，7)、12 h(4，8)組肺組織PARP-1 mRNA的表達(dá)

討論多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是一類(lèi)普遍存在于真核細(xì)胞(除外酵母菌)中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，是一個(gè)至少由18種蛋白組成的大家族，包括PARP-1、PARP-2、PARP-3、Vault-PARP和Tankyrases等亞型[2]。PARP-1約占細(xì)胞PARP活性的90%以上[7]，被認(rèn)為是DNA損傷的感受器，在修復(fù)DNA斷裂、維持基因組的完整性方面起著重要的作用。

PARP-1所涉及炎癥的病理過(guò)程，包括關(guān)節(jié)炎、Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎，以及膿毒癥、嚴(yán)重?zé)齻?、胰腺炎并發(fā)的多器官功能障礙等[3]。過(guò)強(qiáng)的DNA損傷可引起PARP-1過(guò)度激活，產(chǎn)生的PAR會(huì)導(dǎo)致尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和ATP耗竭，同時(shí)也破壞了細(xì)胞核內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境，引起細(xì)胞死亡、組織損傷和器官衰竭，導(dǎo)致病情惡化甚至死亡率升高[2-4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制模后大鼠血清淀粉酶升高，胰腺病理?yè)p傷加重，肺組織濕/干比和病理評(píng)分明顯升高。同時(shí)，肺組織PARP-1 mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)，且表達(dá)水平與胰腺損傷程度、肺損傷程度呈正相關(guān)，表明大鼠肺組織內(nèi)PARP-1參與了胰腺炎時(shí)肺損傷的發(fā)病過(guò)程，與Mota等的研究結(jié)果一致。其機(jī)制可能是：(1)通過(guò)激活NF-κB等炎癥信號(hào)通路，引起TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放增多，造成器官組織損傷；(2)嗜中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶釋放，促使活性氧生成增加，引起DNA單鏈斷裂，導(dǎo)致PARP-1過(guò)度活化和細(xì)胞能量?jī)?chǔ)備的耗竭，從而使線粒體氧自由基產(chǎn)生，胰腺和肺臟細(xì)胞壞死[8-9]。

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2009-07-22)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.020

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(2008CDB394)

430060 武漢，武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科(余佳、王衛(wèi)星、徐勝、鄧文宏、陳曉燕、崔周軍、陳辰)；廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科(徐勝)

王衛(wèi)星，Email:sate.llite@163.com