益生菌型腸內(nèi)營養(yǎng)對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠炎癥反應(yīng)和免疫功能的影響

王曉亮 湯志剛 翁海燕 黃強(qiáng) 陳炯 胡曄

·論著·

益生菌型腸內(nèi)營養(yǎng)對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠炎癥反應(yīng)和免疫功能的影響

王曉亮 湯志剛 翁海燕 黃強(qiáng) 陳炯 胡曄

目的評(píng)價(jià)早期應(yīng)用益生菌型腸內(nèi)營養(yǎng)對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠炎癥反應(yīng)和免疫功能的影響。方法100只SD大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、ANP組、傳統(tǒng)腸內(nèi)營養(yǎng)(瑞素)組、益生菌組和瑞素+益生菌(聯(lián)合)組，每組20只。采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉1.5 ml/kg體重方法制備ANP模型。另經(jīng)胃留置空腸營養(yǎng)管。各組于術(shù)后12、24、48、72 h分批處死大鼠，取血檢測(cè)血清巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、淀粉酶水平及T細(xì)胞亞群，取胰腺組織常規(guī)病理檢查，并采用免疫組化法檢測(cè)胰腺組織MIF的表達(dá)。結(jié)果制模后各組MIF、淀粉酶水平較對(duì)照組明顯升高。制模后72 h，瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組血MIF水平分別為(117.59±1.86)μg/L、(108.39±1.99) μg/L和(95.33±1.96) μg/L，血淀粉酶水平分別為(2799±161)U/L、(2482±140)U/L和(2146±572)U/L，益生菌組和聯(lián)合組均較瑞素組顯著下降(P<0.05)，聯(lián)合組又較益生菌組顯著下降(P<0.05)。制模后各組CD3+、CD4+細(xì)胞和CD4+/CD8+值較對(duì)照組下降。制模后72 h，瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組的CD4+/CD8+值分別為0.93±0.12、1.31±0.13、1.51±0.10，益生菌組和聯(lián)合組均較瑞素組顯著回升(P<0.05)，聯(lián)合組又較益生菌組顯著回升(P<0.05)。對(duì)照組、ANP組、瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組MIF陽性表達(dá)率分別為45%、96%、95%、65%和60%，益生菌組和聯(lián)合組較ANP組和瑞素組顯著降低(P<0.05)。制模后72 h聯(lián)合組大鼠胰腺病理損傷較瑞素組和益生菌組輕。結(jié)論益生菌型腸內(nèi)營養(yǎng)能有效調(diào)節(jié)ANP大鼠炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

胰腺炎，急性壞死性； 腸道營養(yǎng)； 益生菌

腸內(nèi)營養(yǎng)在重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)中的治療作用已得到多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的證實(shí)[1-2]，但關(guān)于益生菌型腸內(nèi)營養(yǎng)對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答功能影響的研究報(bào)道較少[3-4]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討益生菌型腸內(nèi)營養(yǎng)對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠炎癥反應(yīng)、免疫功能的影響，以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

材料與方法

一、模型制備及實(shí)驗(yàn)分組

雄性SD大鼠100只，體重260～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、ANP組、瑞素組、益生菌組(雙岐桿菌、嗜酸乳桿菌、腸球菌三聯(lián)活菌制劑)和瑞素+益生菌(聯(lián)合)組，每組20只大鼠。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c1.5 ml/kg體重方法制備ANP模型。另經(jīng)胃造口置內(nèi)徑1 mm硅膠管于空腸上段2 cm處。對(duì)照組輕翻胰腺后縫合切口。術(shù)后6 h用2 ml生理鹽水沖洗腸管，8 h后瑞素組腸內(nèi)灌注25%瑞素液(華瑞制藥有限公司)5 ml，益生菌組灌注益生菌制劑(上海信誼制藥總廠產(chǎn)品)5 ml，聯(lián)合組將益生菌置于5 ml 25%瑞素液中灌注。灌注前測(cè)定含菌活量達(dá)109CFU/ml。每隔2 h灌注1次，共8次。術(shù)后12、24、48、72 h分批處死大鼠，取血及胰腺組織。

二、淀粉酶、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)檢測(cè)

經(jīng)Beckman全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清淀粉酶水平，采用ELISA法(試劑盒購自R&D公司)檢測(cè)MIF水平。

三、T細(xì)胞亞群檢測(cè)

取外周抗凝血2 ml加淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心收集淋巴細(xì)胞。取1×105個(gè)細(xì)胞，加入抗CD3+、CD4+、CD8+抗體，4℃避光孵育30 min，立即上流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter公司，型號(hào)EPICS-XLII)進(jìn)行檢測(cè)。

四、胰腺病理檢查及MIF表達(dá)檢測(cè)

胰腺標(biāo)本常規(guī)病理檢查。采用免疫組化染色檢測(cè)胰腺組織MIF表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。以胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，以陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)判染色強(qiáng)度：﹤5%為-，5%～25%為+，﹥25%為++。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般情況

各組大鼠均無腸內(nèi)營養(yǎng)所致并發(fā)癥發(fā)生。建模后72 h，各組死亡率分別為0(0/20)、55.0%(11/20)、40.0%(8/20)、25.0%(5/20)、25.0%(5/20)。

二、血淀粉酶和MIF水平變化

制模后12 h，ANP組、瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組血清淀粉酶、MIF水平均較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。制模后72 h，ANP組維持高水平，益生菌組和聯(lián)合組下降且均較瑞素組顯著(P<0.05)，聯(lián)合組的MIF水平又較益生菌組下降顯著(P<0.05，表1)。

三、T細(xì)胞亞群變化

制模后12 h，ANP組、瑞素組、益生菌組和聯(lián)合組CD3+、CD4+細(xì)胞和CD4+/CD8+值均較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)。制模后72 h，ANP組維持低值，益生菌組和聯(lián)合組CD3+、CD4+細(xì)胞和CD4+/CD8+值回升，且明顯高于瑞素組(P<0.05)，聯(lián)合組又較益生菌組回升明顯(P<0．05，表1)。

四、胰腺病理學(xué)改變及MIF的表達(dá)

對(duì)照組胰腺組織輕度水腫及少量炎癥細(xì)胞浸潤；ANP組胰腺明顯出血、壞死，腺泡結(jié)構(gòu)破壞；瑞素組胰腺組織部分出現(xiàn)壞死及出血，腺小葉結(jié)構(gòu)消失；益生菌組和聯(lián)合組胰腺病變程度相似，均較瑞素組輕(圖1)。

對(duì)照組胰腺組織MIF弱表達(dá)，ANP組和瑞素組陽性細(xì)胞數(shù)增加、染色增強(qiáng)，而益生菌和聯(lián)合組胰腺組織MIF表達(dá)較瑞素組減弱(圖2)。5組MIF陽性表達(dá)率分別為45%、96%、95%、65%和60%，益生菌組和聯(lián)合組較ANP組和瑞素組顯著降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠T細(xì)胞亞群、血清淀粉酶水平、MIF濃度的比較

注：與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05；與瑞素組比較，cP<0.05；與益生菌組比較，dP<0.05

a.對(duì)照組；b.ANP組；c.瑞素組；d.益生菌組；e.聯(lián)合組(HE ×200)

a.對(duì)照組；b.ANP組；c.瑞蘇組；d.益生菌組；e.聯(lián)合組(免疫組化 ×400)

SAP時(shí)，由于腸道動(dòng)力紊亂、腸道菌群失調(diào)、腸黏膜上皮細(xì)胞過度凋亡，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷，腸道菌群易位，易并發(fā)感染和多器官功能不全綜合征(MODS)，成為SAP患者后期高病死率的重要原因。目前，免疫功能在急性胰腺炎病理生理過程中的重要性日益受到關(guān)注，如何增強(qiáng)腸道局部和系統(tǒng)免疫功能成為SAP臨床和實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。

T細(xì)胞亞群的變化反映了細(xì)胞免疫功能的改變，CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值降低表明機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)[5]。MIF是先天性免疫和獲得性免疫的重要調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)中起重要作用，可能會(huì)加重SAP及相關(guān)肺損傷[6]。益生菌型腸內(nèi)營養(yǎng)是指增加益生菌的營養(yǎng)制劑，它可建立宿主和微生物之間的共生關(guān)系，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞更新，增加腸黏膜血流量和調(diào)節(jié)腸蠕動(dòng)，加強(qiáng)腸黏膜免疫系統(tǒng)的功能[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠無死亡，ANP組死亡率較高，但各組之間死亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。制模后各組血清淀粉酶、MIF水平升高。制模后72 h，給予營養(yǎng)支持的3組血淀粉酶及MIF水平均下降，其中聯(lián)合組下降較益生菌組顯著，益生菌組又較瑞素組下降顯著，表明聯(lián)合益生菌行腸內(nèi)營養(yǎng)在減輕炎癥反應(yīng)方面效果更好。制模后各組CD3+、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+比值均降低，提示ANP早期已有不同程度的免疫功能抑制。制模后72 h，營養(yǎng)支持各組各指標(biāo)回升，其中聯(lián)合組回升最高，提示聯(lián)合組的營養(yǎng)支持對(duì)ANP大鼠免疫抑制狀態(tài)的改善，抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放效果最明顯。胰腺組織病理的改變及MIF表達(dá)的變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，臨床上應(yīng)推薦使用益生菌型腸內(nèi)營養(yǎng)。

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2009-05-06)

(本文編輯：屠振興)

Effectofprobioticsenteralnutritionontheinflammatoryresponseandimmunefunctioninratswithacutenecrotizingpancreatitis

WANGXiao-liang,TANGZhi-gang,WENGHai-yan,HUANGQiang,CHENJiong,HUYe.

DepartmentofGeneralSurgery,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China

TANGZhi-gang,Email:tougao_100@163.com

ObjectivesTo evaluate the effect of probiotics enteral nutrition therapy on the inflammatory reaction and immune function in acute necrotizing pancreatitis (ANP) in rats.Methods100 SD rats were divided randomly into control group (C group,n=20), ANP group, enteral nutrition group (EN group,n=20), probiotics group (P group,n=20) and enteral nutrition plus probiotics group (PEN group,n=20). ANP were induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate (1.5 ml/kg) into the biliary and pancreatic duct. The nasojejunal tube was placed via gastric route. The rats were sacrificed at 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after ANP modeling. Serum MIF and amylase levels, as well as CD3+, CD4+, CD8+were measured and MIF was determined by immunohistochemistry and the histopathological changes in pancreatic tissue were observed.ResultsSerum MIF and amylase levels were all increased when compared with that in C group. 72 h after ANP modeling, serum MIF levels in EN, P, PEN groups were (117.59±1.86)μg/L,(108.39±1.99)μg/L and (95.33±1.96)μg/L, respectively; serum amylase levels were (2799±161)U/L, (2482±140)U/L and (2146±572)U/L, respectively; the values in P and PEN groups were significantly lower than that of EN group (P<0.05), the values in PEN groups were significantly lower than that of P group (P<0.05). After ANP induction, CD4+/CD8+values in EN, P and PEN groups were 0.93±0.12, 1.31±0.13, 1.51±0.10, respectively; the values in P and PEN groups were significantly higher than that of EN group (P<0.05), the values in PEN groups were significantly higher than that of P group (P<0.05). MIF positive rates in C, ANP, EN, P and PEN group were 45%, 96%, 95%, 65% and 60%,respectively; the values in P and PEN groups were significantly lower than those of ANP and EN group (P<0.05). At 72 h, the damage of pancreatic tissue was more severe in EN and P groups than that in PEN group.ConclusionsProbiotics enteral nutrition could effectively regulate inflammation mediator and cytokines in rats with ANP, and enhance immune function.

Pancreatitis, acute necrotizing； Enteral nutrition； Probiotics

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.013

2008年安徽省臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科新技術(shù)引進(jìn)項(xiàng)目(2008N017)

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湯志剛，Email:tougao_100@163.com