MCP-1在小型豬慢性阻塞性胰腺炎組織中的表達(dá)及其意義

邊洋 塔娜 李林 鄭嶠 張順民 鄭建明 左長京

·論著·

MCP-1在小型豬慢性阻塞性胰腺炎組織中的表達(dá)及其意義

邊洋 塔娜 李林 鄭嶠 張順民 鄭建明 左長京

目的檢測慢性阻塞性胰腺炎小型豬血單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)含量及胰腺組織MCP-1蛋白表達(dá)，探討其在胰腺纖維化中的作用。方法采用不全結(jié)扎主胰管方法建立小型豬慢性阻塞性胰腺炎模型，術(shù)后4、6、8周分批處死動物。觀察胰腺病理變化；膠原(VG)染色評估胰腺纖維化程度；ELISA法檢測血MCP-1濃度；免疫組化法檢測胰腺組織MCP-1、α-SMA、PDGF、TGF-β1和NF-κB表達(dá)。結(jié)果造模成功14頭(58.3%)。術(shù)后4周起胰腺體尾部呈萎縮性改變，間質(zhì)纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤，第8周改變最明顯。胰腺纖維化Ⅰ期5頭(35.7%)，Ⅱ期4頭(28.6%)，Ⅲ期5頭(35.7%)。術(shù)后4、6、8周造模成功組血MCP-1含量分別為(102.44±36.25)pg/ml、(97.84±28.67)pg/ml、(94.32±28.42)pg/ml，顯著高于對照組的(10.42±5.86)pg/ml、(8.58±4.86)pg/ml、(8.22±4.58)pg/ml(P值均<0.01)。對照組胰腺無MCP-1蛋白表達(dá)，造模成功組胰腺組織內(nèi)見MCP-1蛋白表達(dá)，且MCP-1表達(dá)與α-SMA、PDGF、TGF-β1和NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論MCP-1在慢性阻塞性胰腺炎胰腺纖維化過程中起重要作用。

胰腺炎，慢性； 趨化因子類； 單核細(xì)胞趨化蛋白-1； 星形細(xì)胞； 纖維化

單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)是CC類趨化因子家族中的主要成員之一，對單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化活性，在免疫炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化等一系列疾病過程中發(fā)揮重要作用。近年來研究表明，MCP-1在慢性胰腺炎(CP)胰腺纖維化過程中發(fā)揮著十分重要的作用。本文檢測慢性阻塞性胰腺炎小型豬的血MCP-1含量及胰腺組織MCP-1蛋白表達(dá)，探討其在胰腺纖維化發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及分組

36頭20～25 kg的雌性巴馬小型豬，月齡6～12個月，體重20～ 25 kg，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。按數(shù)字表法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(24頭)和對照組(12頭)。參考文獻(xiàn)[1]的方法，即用3.0號絲線把主胰管與雙股3.0號聚丙烯線一起結(jié)扎，建立阻塞性胰腺炎模型。對照組僅翻動胰腺數(shù)次。術(shù)中取右葉胰腺組織置-180℃液氮保存。造模后4、6、8周分批處死動物，取胰腺常規(guī)固定。術(shù)后4、6、8周抽取外周血，分離血清備用。

二、血MCP-1濃度檢測

采用ELISA法，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，嚴(yán)格按說明書操作。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定各孔A450值。用MCP-1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中MCP-1的含量。

三、胰腺病理形態(tài)學(xué)觀察及膠原纖維染色

常規(guī)行病理學(xué)檢查。按照胰腺腺泡萎縮、炎細(xì)胞浸潤和纖維化程度(主要根據(jù)胰腺纖維化的程度)分為三期[2]：Ⅰ期為輕微纖維化，即間質(zhì)纖維組織輕度增生，胰腺腺泡輕度萎縮，較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞浸潤；Ⅱ期為中度纖維化，即纖維組織明顯增生，胰腺腺泡明顯萎縮，間質(zhì)內(nèi)較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤；Ⅲ期 為重度纖維化，即間質(zhì)纖維組織大量增生，胰腺的外分泌實(shí)質(zhì)幾乎完全被破壞，胰腺腺泡顯著萎縮，間質(zhì)內(nèi)少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤。同時，采用VG染色觀察胰腺組織纖維化程度。

四、胰腺組織蛋白表達(dá)的檢測

采用免疫組化方法，按說明書操作?？筆DGF、TGF-β1、NF-κB和α-SMA抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。用TBS代替一抗作為空白對照。MCP-1、PDGF、TGF-β1和α-SMA均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，NF-κB表達(dá)于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：未染色，0分；黃褐色1分；褐色2分；深褐色3分。按陽性細(xì)胞率評分：<5% 0分；5%～10% 1分；11%～25% 2分；26%～50% 3分；>50% 4分。將兩分值相加， ≤2分為陰性，>2分為陽性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、造模成功率

實(shí)驗(yàn)組1頭豬因麻醉意外死亡，2頭在造模術(shù)后1～2周內(nèi)死亡，解剖顯示胰管損傷，胰液外漏伴腹腔感染。實(shí)驗(yàn)組造模成功14頭，成功率58.3%。

二、血MCP-1含量的變化

術(shù)后4、6、8周對照組血MCP-1含量分別為(10.42±5.86)pg/ml、(8.58±4.86)pg/ml、(8.22±4.58)pg/ml；造模成功組分別為(102.44±36.25)pg/ml、(97.84±28.67)pg/ml、(94.32±28.42)pg/ml，兩組相差顯著(P值均<0.01)。

三、胰腺病理學(xué)變化

對照組胰腺無病理形態(tài)學(xué)改變。造模成功組自術(shù)后4周起胰腺呈灰紅色，質(zhì)地較硬(圖1)，體尾部輕度萎縮，切面結(jié)節(jié)狀。鏡檢示胰腺分葉狀結(jié)構(gòu)不同程度遭到破壞，胰腺腺泡萎縮、纖維組織增生，間質(zhì)內(nèi)散在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(圖2)，VG染色示大量纖維組織增生(圖3)，以術(shù)后8周改變最明顯。其中Ⅰ期5頭(35.7%)，Ⅱ期4頭(28.6%)，Ⅲ期5頭(35.7%)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期豬的血MCP-1含量分別為(100.38±28.42)pg/ml、(98.26±24.36)pg/ml和(96.28±26.44)pg/ml，無顯著差異。

四、MCP-1、PDGF、TGF-β1、NF-κB和α-SMA蛋白的表達(dá)

造模成功組造模后4、6、8周胰腺組織內(nèi)均見MCP-1蛋白表達(dá)，定位于胰腺泡心導(dǎo)管、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(圖4)，且隨分期增加表達(dá)逐漸增強(qiáng)，以Ⅲ期最為顯著(表1)，但無顯著性差異。MCP-1蛋白表達(dá)與α-SMA、PDGF、TGF-β1和NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。

圖1實(shí)驗(yàn)組4周的胰腺圖2胰腺的病理改變(HE ×100)圖3胰腺內(nèi)大量纖維組織增生(VG ×100)圖4胰腺M(fèi)CP-1蛋白表達(dá)(免疫組化 ×200)

分期例數(shù)MCP-1α-SMAPDGFTGF-β1NF-κBⅠ期55.4±0.45.5±0.54.8±0.65.2±0.65.3±0.5Ⅱ期45.7±0.55.8±0.65.4±0.45.3±0.55.6±0.5Ⅲ期56.3±0.66.1±0.65.6±0.65.4±0.66.3±0.6

討 論

以往CP動物模型多以鼠、貓等小型動物為對象，采用飲食、蛙皮素靜脈內(nèi)注射及胰管內(nèi)注射等方法制成和人類相似的CP，但對于影像診斷和外科治療的實(shí)驗(yàn)研究有一定的局限性。由于豬的消化系統(tǒng)和人很相似，且能夠滿足影像診斷和外科治療的要求，因此豬是較理想的CP模型動物。目前已有采用主胰管結(jié)扎法建立豬CP模型的報道[2-3]。本實(shí)驗(yàn)選擇巴馬小型豬制作慢性阻塞性胰腺炎模型，結(jié)果顯示其病理表現(xiàn)與人類的慢性阻塞性胰腺炎類似。

CP與免疫、細(xì)胞因子、基因突變、細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系，其中細(xì)胞因子在CP胰腺纖維化過程中起著十分重要的作用[3]。Inoue等[4]以二丁基二氯化錫誘導(dǎo)大鼠CP模型，其胰腺組織和血清中MCP-1 mRNA和蛋白濃度均明顯增加。Zhao等[5]給該模型肌內(nèi)注射能與MCP-1競爭結(jié)合的MCP-1突變體，結(jié)果血清MCP-1水平明顯下降，胰腺炎癥和纖維化發(fā)生率下降50%。Saurer等[6]用原位雜交方法檢測23例CP和4例對照正常胰腺組織MCP-1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，MCP-1 mRNA在正常胰腺組織中不表達(dá)，CP組織則強(qiáng)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺M(fèi)CP-1的蛋白表達(dá)及血MCP-1含量隨CP分期增加逐漸增強(qiáng)，以Ⅲ期最為顯著。

Gharaee-Kermani等[7]報道，MCP-1通過上調(diào)TGF-β1水平促進(jìn)纖維化發(fā)生。Zhao等[5]報道，抗MCP-1基因治療能顯著降低胰腺TGF-β、PDGF、IL-1β和IL-6表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，MCP-1與α-SMA、PDGF、TGF-β1和NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)。

[1] Boerma D,Straatsburg IH,Offerhaus GJ,et al.Experimental model of obstructive,chronic pancreatitis in pigs.Dig Surg,2003,20:520-526.

[2] Stolte.Chronic pancreatitis.Verh Dtsch Ges Pathol(Germany)，1987，71：175-185.

[3] Michalski CW,Gorbachevski A,Erkan M,et al.Mononuclear cells modulate the activity of pancreatic stellate cells which in turn promote fibros is and inflammation in chronic pancreatitis.J Transl Med,2007,5:63-73.

[4] Inoue M, Ino Y,Gibo J,et al.The role of monocyte chemoattractant protein-1 in experimental chronic pancreatitis model induced by dibutyltin dichloride in rats. Pancreas,2002;25:e64-e70.

[5] Zhao HF，Ito T，Gibo J，et al．Anti-monocyte chemoattractant protein 1 gene therapy attenuates experimental chronic pancreatitis induced by dibutyhin dichloride in rats．Gut，2005,54:1759-l767.

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[7] Gharaee-Kermani M,Denholm EM,Phan SH.Costimulation of fibroblast collagen and transforming growth factor b1 gene expression by monocyte chemoattractant protein-1 via specific receptors.J BiolChem,1996,271:17779-17784.

2010-04-07)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofMCP-1inthepancreasofpigletwithchronicobstructivepancreatitisanditssignificance

BIANYang,TANa,LILin,ZHENGQiao,ZHANGShun-min,ZHENGJian-ming,ZUOChang-jing.

Grade2007,Five-yearClinicalCourse,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo determine the serum concentration of MCP-1 and the expression of MCP-1 protein in the pancreas in the piglet with chronic obstructive pancreatitis and to explore the role of MCP-1 protein in pancreatic fibrosisits.MethodsThe piglet model of chronic obstructive pancreatitis was established by incomplete ligation of the pancreatic duct. The piglets were sacrificed at 4, 6, 8 weeks after induction. Pathological changes of pancreas were examined. Pancreatic fibrosis was assessed by VG staining. Serum MCP-1 concentrations were detected by ELISA method. MCP-1 and α-SMA, PDGF, TGF-β1 and NF-κB protein expression were detected by immunohistochemistry.ResultsThe induction was successful in 14 piglets (58.3%). Mild atrophic changes, interstitial fibrosis, chronic inflammatory cell infiltration could be observed in the body and tail of pancreas from the 4th week in the experimental group. The most obvious changes occurred in the 8th week. Stage I pancreatic fibrosis occurred in 5 piglets (35.7%), stage Ⅱ in 4 piglets (28.6%), stage Ⅲ in 5 rats (35.7%). Seurm MCP-1 at 4, 6, 8 weeks was (102.44±36.25)pg/ml, (97.84±28.67)pg/ml, (94.32±28.42)pg/ml,respectively, and was significantly higher than that in control group [(10.42±5.86)pg/ml, (8.58±4.86)pg/ml, (8.22±4.58)pg/ml,P<0.01]. There was no MCP-1 protein expression in the control group; MCP-1 protein was detected in the successful induction group, and MCP-1 expression was positively correlated with expressions of the PDGF, TGF-β1, α-SMA and NF-κB.ConclusionsMCP-1 may play an important role in the course of pancreatic fibrosis in chronic obstructive pancreatitis.

Pancreatitis, chronic; Chemotactic factors; Monocyte chemoattractant protein-1; Astrocytes; Fibrosis

Commoncorrespondingauthor:ZHENGJian-ming,Email:jmzheng1962@163.com;ZUOChang-jing,Email:changjing.zuo@gmail.com

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.011

上海市科委國際合作科研基金(10410708800)；2009年校大學(xué)生創(chuàng)新能力培養(yǎng)計(jì)劃立項(xiàng)課題面上項(xiàng)目

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)本科五年制2007級學(xué)員隊(duì)(邊洋、塔娜、李林、鄭嶠)；長海醫(yī)院病理科(張順民、鄭建明)，核醫(yī)學(xué)科(左長京)

共同通信作者：鄭建明，Email:jmzheng1962@163.com；左長京，Email:changjing.zuo@gmail.com