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    Toll樣受體4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在重癥急性胰腺炎肺損傷中的表達(dá)及血必凈的干預(yù)作用

    2010-11-23 08:13:41康新劉國(guó)輝路小光范治偉白黎智劉莉龐洪剛康利民紀(jì)春陽(yáng)
    中華胰腺病雜志 2010年6期
    關(guān)鍵詞:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)毒素淀粉酶

    康新 劉國(guó)輝 路小光 范治偉 白黎智 劉莉 龐洪剛 康利民 紀(jì)春陽(yáng)

    ·短篇論著·

    Toll樣受體4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在重癥急性胰腺炎肺損傷中的表達(dá)及血必凈的干預(yù)作用

    康新 劉國(guó)輝 路小光 范治偉 白黎智 劉莉 龐洪剛 康利民 紀(jì)春陽(yáng)

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是重癥急性胰腺炎(SAP)最常見(jiàn)的早期并發(fā)癥,發(fā)生率高達(dá)33%,發(fā)病1周內(nèi)病死的SAP患者中60%~80%與ALI/ARDS有關(guān)[1-2]。Toll樣受體(TLR)家族成員在識(shí)別病原體并介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)中具有重要作用,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括NF-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和應(yīng)激活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3-4]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血必凈干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)ALI的大鼠,觀察其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB表達(dá)的影響,探討血必凈的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    一、材料與方法

    1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:健康清潔級(jí)SD大鼠96只,體重(220±20)g,雌雄不拘,購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后抽簽法隨機(jī)分為假手術(shù)組、ANP并發(fā)ALI(ANP-ALI)組和血必凈組,每組32只。采用胰膽管逆行緩慢注射4%?;悄懰徕c(美國(guó)Sigma公司)1 ml/kg體重方法制備ANP-ALI模型。同時(shí)選取空腸起始部以下約2 cm處置入造瘺管經(jīng)由皮下引出體外,妥善固定。假手術(shù)組觸摸胰腺數(shù)次及空腸造瘺后關(guān)腹。血必凈組于制模后0.5 h經(jīng)瘺管注入血必凈(天津紅日藥業(yè)有限公司贈(zèng)送)2 ml;假手術(shù)組和ANP-ALI組注入等容積生理鹽水。術(shù)后3、6、12、24 h分批處死大鼠8只,取血及胰腺、肺組織。

    2.血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2、內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β含量測(cè)定:用全自動(dòng)生化儀(57600-010,日本日立公司)測(cè)定血清淀粉酶、Ca2+含量。Bayer血?dú)夥治鰞x測(cè)定血PaO2、PaCO2。應(yīng)用內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒(天津一瑞生物工程有限公司)在MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)中檢測(cè)血清內(nèi)毒素含量,按說(shuō)明書(shū)操作,由標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)血清內(nèi)毒素含量。采用ELISA法檢查血清TNF-α、IL-1β含量,試劑盒購(gòu)自Sigma公司,按說(shuō)明書(shū)操作。

    3.肺組織病理學(xué)檢查、肺損傷評(píng)分以及濕/干重比測(cè)定:取右肺上、中葉,常規(guī)病理檢查,采用Osman等[5]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺損傷評(píng)分。取左肺稱(chēng)重,置80℃電熱干燥箱內(nèi)烤72 h ,再稱(chēng)干重,按[(肺濕重-肺干重)/ 肺干重]×100%計(jì)算肺組織濕/干重比(W/D)。

    4.肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè):取100 g右下肺組織,電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿, BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)行Western blotting??筎LR4、NF-κB一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司,ECL發(fā)光劑顯影后硝酸纖維素膜在FluorSMutilmager圖像分析儀上用QuantityOne4.1圖像分析軟件進(jìn)行分析,以相應(yīng)蛋白條帶面積的平均灰度值表示TLR4、NF-κB p65活化水平的相對(duì)含量。

    二、結(jié)果

    1.血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2、內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β含量的變化:ANP-ALI組術(shù)后血清淀粉酶、內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β含量及PaCO2較假手術(shù)組均顯著升高(P<0.05或P<0.01),而血必凈組較ANP-ALI組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。ANP-ALI組術(shù)后血Ca2+、PaO2均較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01),而血必凈組較ANP-ALI組顯著升高(P<0.05,表1)。

    2.肺組織病理學(xué)改變和濕/干重比:ANP-ALI組術(shù)后3 h肺組織輕度水腫,鏡下見(jiàn)間質(zhì)水腫、充血、少量單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);6、12 h病變加重;術(shù)后24 h肺呈暗紅色,出現(xiàn)片狀出血及淤血改變,切面有大量暗紅色血性液體滲出,鏡下見(jiàn)肺泡和間質(zhì)重度水腫、出血,肺泡間隔增寬,大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),組織結(jié)構(gòu)紊亂。血必凈組各時(shí)間點(diǎn)肺組織的損傷均較ANP-ALI組明顯減輕(圖1)。ANP-ALI組的肺損傷評(píng)分及濕/干重比均較假手術(shù)組顯著增加,而血必凈組較ANP-ALI組顯著降低(P<0.05或P<0.01,表2)。

    3.肺組織TLR4、NF-κB p65表達(dá)變化: ANP-ALI組TLR4和NF-κB p65表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05或P<0.01),而血必凈組較ANP-ALI組顯著降低(P<0.05,圖2,表2)。

    表1 各組血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2及血清內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β含量

    注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05,bP<0.01;與ANP-ALI組比較,cP<0.05,dP<0.01;1 mmHg=0.133 kPa

    表2 肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比及TLR4、NF-κB p65表達(dá)變化

    注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05,bP<0.01;與ANP-ALI組比較,cP<0.05,dP<0.01

    圖1假手術(shù)組(a)、ANP-ALI組(b)和血必凈組(c)術(shù)后3(上)、24 h(下)的肺組織病理改變(HE ×200)

    圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組肺組織TLR4與NF-κB的表達(dá)

    討論研究發(fā)現(xiàn),SAP常伴發(fā)腸源性?xún)?nèi)毒素(LPS)血癥,在推動(dòng)ANP-ALI病程發(fā)展中起重要作用[6-7]。Toll受體家族既是LPS的信號(hào)分子,也是LPS的受體。分布在單核巨噬細(xì)胞表面的TLR4對(duì)LPS炎癥信號(hào)向胞內(nèi)傳導(dǎo)起主要作用,是LPS的優(yōu)先受體[8]。NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞中具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,它能參與多種炎癥細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá),參與多種疾病過(guò)程。NF-κB與基因啟動(dòng)子和(或)增強(qiáng)子中特定的κ序列結(jié)合,啟動(dòng)和調(diào)控眾多參與炎癥過(guò)程細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)。近年研究表明,TLR與其配體相結(jié)合后激活NF-κB移入核內(nèi),進(jìn)一步使TNF-α、IL-1β、 IL-6、 IL-8等炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)[9-10]。本結(jié)果顯示,ANP-ALI組大鼠血淀粉酶、PaCO2、內(nèi)毒素及肺組織學(xué)評(píng)分、TNF-α、IL-1β水平均較假手術(shù)組增高,肺組織

    TLR4和NF-κB表達(dá)也同步增加,說(shuō)明ANP大鼠肺組織TLR4和NF-κB也參與了ALI的發(fā)病過(guò)程。

    中藥血必凈注射液的主要有效成分包括紅花、黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶醛等。血必凈干預(yù)后血清淀粉酶、內(nèi)毒素水平、肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比均較ANP-ALI組明顯降低;肺組織TLR4、NF-κB表達(dá)也較ANP-ALI組明顯下降,其下游的TNF-α、IL-1β促炎癥因子表達(dá)也降低。因此推測(cè)血必凈可能在ANP-ALI病程早期抑制腸道內(nèi)細(xì)菌易位,減少了腸源性?xún)?nèi)毒素的產(chǎn)生,降低了內(nèi)毒素對(duì)TLR4的刺激能力,隨后通過(guò)抑制NF-κB p65活化,下調(diào)TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的釋放,從而減輕肺組織損傷,阻止SAP的病程進(jìn)展。

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    2010-02-22)

    (本文編輯:呂芳萍)

    10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.019

    116001 大連,大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診外科(康新、路小光、范治偉、白黎智、劉莉、龐洪剛、康利民、紀(jì)春陽(yáng)) ;吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科 (劉國(guó)輝)

    路小光,Email:kangxinhao1@yahoo.com.cn

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