AMD3100對(duì)胰腺癌細(xì)胞AsPC-1及其移植瘤血管生成的影響

高振軍 孔慶云 吳愷 王興鵬

·論著·

AMD3100對(duì)胰腺癌細(xì)胞AsPC-1及其移植瘤血管生成的影響

高振軍 孔慶云 吳愷 王興鵬

目的探討非肽類特異性CXCR4拮抗劑AMD3100對(duì)胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1細(xì)胞增殖及其移植瘤生長(zhǎng)的影響。方法AsPC-1細(xì)胞分為對(duì)照組、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1α)處理組、AMD3100處理組和SDF-1α+AMD3100處理組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Western blotting檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)。建立AsPC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，應(yīng)用AMD3100瘤內(nèi)及瘤周注射，觀察移植瘤的生長(zhǎng)，免疫組化法檢測(cè)裸鼠移植瘤的微血管密度(microvessel density, MVD)。結(jié)果SDF-1α可明顯促進(jìn)AsPC-1細(xì)胞增殖(1.430±0.122對(duì)1.002±0.001，P<0.05)，而同時(shí)應(yīng)用AMD3100處理能抑制這種增殖反應(yīng)(0.983±0.068 對(duì) 1.430±0.122，P<0.05)；SDF-1α亦可促進(jìn)AsPC-1細(xì)胞VEGF的表達(dá)(0.565±0.047 對(duì) 0.439±0.034，P<0.05)，而同時(shí)用AMD3100處理可抑制這種效應(yīng)(0.450±0.071 對(duì) 0.565±0.047，P<0.05)。AMD3100可抑制AsPC-1細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)，第24天的抑瘤率達(dá)59.5%，移植瘤的MVD顯著減少(28.56±6.94 對(duì) 98.75±20.60，P<0.01)。結(jié)論AMD3100在體外和體內(nèi)均可抑制AsPC-1細(xì)胞增殖及其移植瘤的血管生成。

胰腺腫瘤； AMD3100； 細(xì)胞增殖； 血管生成

胰腺癌是一種具有高侵襲傾向的惡性腫瘤，80%以上的病例會(huì)發(fā)生局部蔓延和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)是一類在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中受到越來(lái)越多關(guān)注的趨化因子，與其受體結(jié)合可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成[2-3]。AMD3100是一種小分子非肽類特異性CXCR4拮抗劑，屬于雙螯環(huán)類(Bicyclam)化合物，可與CXCR4第二胞外環(huán)的門冬氨酸殘基結(jié)合，抑制SDF-1與CXCR4結(jié)合，以及由此引發(fā)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。本研究旨在觀察SDF-1α及AMD3100對(duì)胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1細(xì)胞增殖及其移植瘤血管生成的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

二、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，貼壁生長(zhǎng)后換無(wú)血清培養(yǎng)基，分成4組，分別加AMD3100(Sigma-Aldrich公司) 100 ng/ml、SDF-1α(Peprotech公司)100 ng/ml及SDF-1α+AMD3100和只加無(wú)血清培養(yǎng)基的對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加5 mg/ml的MTT(Sigma-Aldrich公司)20 μl，培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定A490值。

三、細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blotting法。提取上述各組培養(yǎng)24 h細(xì)胞的總蛋白，常規(guī)行Western blotting?？筕EGF一抗1∶500稀釋、二抗1∶500稀釋，最后ECL發(fā)光。以β-actin為內(nèi)參照。圖像掃描儀掃描條帶灰度值，以VEGF條帶與β-actin條帶灰度值比表示VEGF相對(duì)表達(dá)量。

四、動(dòng)物及體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

Balb/c裸鼠，雌性，5～6周齡，體重20 g左右，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證書No.159)。實(shí)驗(yàn)前在SPF級(jí)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。無(wú)菌條件下給每只裸鼠背部皮下接種AsPC-1細(xì)胞2×106個(gè)，以皮下結(jié)節(jié)直徑>0.5 mm3為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。1周后將10只成瘤裸鼠數(shù)字表法隨機(jī)分為AMD組和對(duì)照組。AMD組在瘤體長(zhǎng)徑達(dá)0.5 cm時(shí)注射AMD3100 7.5 mg/kg體重，一半劑量注入瘤體中央，另一半注射在瘤周，1次/3 d。對(duì)照組注射等容積生理鹽水。每3 d測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑，并計(jì)算腫瘤體積：V=ab2/2(a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。治療后24 d處死動(dòng)物，剝?nèi)×鲶w稱瘤量。抑瘤率(inhibitory rate, IR)=(1 -治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%。并將瘤體迅速放入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

五、移植瘤微血管密度(MVD)檢測(cè)

采用免疫組化SABC染色法，嚴(yán)格按免疫組化染色試劑盒(武漢博士德公司)說(shuō)明操作。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。采用雙盲法閱片。結(jié)果判斷：以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色著色為血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性，在腫瘤區(qū)內(nèi)單個(gè)或成叢的內(nèi)皮細(xì)胞均視為單個(gè)血管，只要結(jié)構(gòu)不連接，其分支也作為血管，凡管徑>8個(gè)紅細(xì)胞或帶有肌層的血管不計(jì)數(shù)。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野(10×40)，計(jì)數(shù)MVD。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、AMD3100對(duì)AsPC-1細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組AsPC-1細(xì)胞增殖的A490值為1.002±0.001。AMD3100處理組細(xì)胞增殖的A490值為1.005±0.110，與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。SDF-1α處理組細(xì)胞增殖的A490值為1.430±0.122，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而同時(shí)用AMD3100處理，則能抑制細(xì)胞增殖反應(yīng)(P<0.05)，A490值為0.983±0.068，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

二、 AMD3100對(duì)AsPC-1細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組、SDF-1α組、AMD3100組和SDF-1α+AMD3100組細(xì)胞的VEGF表達(dá)量分別為0.439±0.034、0.565±0.047、0.426±0.059和0.450±0.071(圖1)。SDF-1α可促進(jìn)AsPC-1細(xì)胞VEGF的表達(dá)(P<0.05)，而同時(shí)應(yīng)用AMD3100可抑制這種促進(jìn)效應(yīng)(P<0.05)。

三、 AMD3100對(duì)AsPC-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

各組裸鼠生長(zhǎng)、飲食、活動(dòng)情況良好，無(wú)死亡。移植瘤外觀呈大的球形瘤結(jié)節(jié)或數(shù)個(gè)小的瘤結(jié)節(jié)簇生(圖2)。AMD3100組移植瘤生長(zhǎng)速度明顯小于對(duì)照組(P<0.05，圖3)，24 d的IR為59.5%。

圖1 AMD3100對(duì)AsPC-1細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

圖2 對(duì)照組(a)、AMD3100組(b)移植瘤離體圖

圖3 裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線

四、裸鼠皮下移植瘤MVD變化

AMD3100瘤內(nèi)注射24 d后，移植瘤的MVD為28.56±6.94，明顯低于對(duì)照組的 98.75±20.60(P<0.01，圖4)。

圖4AMD3100組(a)和對(duì)照組(b)裸鼠皮下移植瘤MVD(IHC ×200)

討 論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，在腫瘤微環(huán)境中具有復(fù)雜的趨化因子/受體網(wǎng)絡(luò)，與腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)[4]，CXCR4在許多惡性腫瘤組織中表達(dá)水平明顯升高，SDF-1和CXCR4結(jié)合激活特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起原位和轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。AMD3100可抑制SDF-1與CXCR4的結(jié)合，阻斷隨后的一系列生理過(guò)程[5]。

Marchesi等[6]發(fā)現(xiàn)，SDF-1α可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SDF-1α可促進(jìn)AsPC-1細(xì)胞增殖，但這種作用可被AMD3100抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦顯示，在AsPC-1細(xì)胞皮下移植瘤體及瘤周注射AMD3100可明顯抑制移植瘤的生長(zhǎng)，24 d時(shí)的抑瘤率接近60%，提示AMD3100在體內(nèi)外均可顯著抑制CXCR4陽(yáng)性胰腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)。

癌細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移中需有新生血管的存在，VEGF是一種有效的促血管生成因子，它與MVD增加、腫瘤局部侵襲和轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)[7]。新近的一項(xiàng)研究認(rèn)為，VEGF是一種CXCR4下游的靶基因[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SDF-1α可促進(jìn)AsPC-1細(xì)胞VEGF的表達(dá)，而AMD3100可抑制這種促進(jìn)作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦顯示AMD3100可抑制移植瘤的血管生成。

[1] Lockhart AC,Rothenberg ML,Berlin JD.Treatment for pancreatic cancer: current therapy and continued progress.Gastroenterology,2005,128:1642-1654.

[2] Muller A,Homey B,Soto H,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature,2001,410:50-56.

[3] Kollmar O,Rupertus K,Scheuer C,et al.Stromal cell-derived factor-1 promotes cell migration and tumor growth of colorectal metastasis.Neoplasia,2007,9:862-870.

[4] O′Hayre M,Salanga CL,Handel TM,et al.Chemokines and cancer: migration, intracellular signalling and intercellular communication in the microenvironment.Biochem J,2008,409:635-649.

[5] Flomenberg N,DiPersio J,Calandra G.Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.Acta Haematol,2005,114:198-205.

[6] Marchesi F,Monti P,Leone BE,et al.Increased survival,proliferation,and migration in metastatic human pancreatic tumor cells expressing functional CXCR4.Cancer Res,2004,64:8420-8427.

[7] Niedergethmann M,Hildenbrand R,Wostbrock B,et al.High expression of vascular endothelial growth factor predicts early recurrence and poor prognosis after curative resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas.Pancreas,2002,25:122-129.

[8] Billadeau DD,Chatterjee S,Bramati P,et al.Characterization of the CXCR4 signaling in pancreatic cancer cells.Int J Gastrointest Cancer,2006,37:110-119.

2009-10-12)

(本文編輯：屠振興)

EffectofAMD3100ontheproliferationandangiogenesisofAsPC-1cells

GAOZhen-jun,KONGQing-yun,WUKai,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,LianyungangFirstHospital,XuzhouMedicalCollege,Lianyungang222002,China

WANGXing-peng,Email:xpwcn@public7.sta.net.cn

ObjectiveTo investigate the effects of blockade on non-peptide specific SDF-1/CXCR4 receptor ligand system with AMD3100 on the proliferation and angiogenesis of human pancreatic cancer cells AsPC-1.MethodsAsPC-1 was divided into control group, SDF-1α group, group, SDF-1α+ AMD3100 group. MTT test was performed to determine the proliferative level of AsPC-1 cells. Vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected with Western blotting assay. Immunohistochemistry was used to detect the microvessel density (MVD) in subcutaneous xenografts of AsPC 1 of nude mice model, which was intratumorally and peritumorally injected with AMD3100.ResultsSDF-1α could induce the proliferation of AsPC-1(1.430±0.122vs1.002± 0.001,P<0.05). While the proliferative effect induced by SDF-1α could be inhibited by AMD3100 (0.983±0.068vs1.430 ± 0.122,P<0.05). SDF-1α could induce the expression of VEGF (0.565 ±0.047vs0.439 ± 0.034,P<0.05). While the protein expression of VEGF induced by SDF-1α on AsPC-1 cells was inhibited by AMD3100 (0.450 ± 0.071vs0.565±0.04,P<0.05). The growth and angiogenesis of subcutaneous xenografts of nude mice model were inhibited by AMD3100; the tumor inhibitory rate was 59.5% at 24th day. The MVD of xenografts was significantly decreased (28.56±6.94vs98.75±20.60,P<0.01).ConclusionsAMD3100 could inhibit the proliferation and angiogenesis of AsPC-1 cells both in vitro and in vivo.

Pancreatic neoplasms; AMD3100; Cell proliferation; Angiogenesis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.010

222002 連云港，徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院消化科(高振軍、孔慶云)；上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(吳愷)；同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化科(王興鵬)

王興鵬，Email: xpwcn@public7.sta. net. cn