急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺代謝特征分析

湯偉 陸建平 汪劍 龔燕芳 蔣斐 王洋 馬超 田冰

·論著·

急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺代謝特征分析

湯偉 陸建平 汪劍 龔燕芳 蔣斐 王洋 馬超 田冰

目的對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠離體胰腺組織塊行高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜分析(HR-MASNMR)，探索其代謝變化特征。方法按完全隨機法將30只Wistar大鼠分為ANP組(20只)和對照組(10只)。ANP組大鼠經(jīng)腹腔分2次注射L-精氨酸2.5 mg/g體重方法制備，對照組僅注射等容積的生理鹽水。運用HR-MASNMR分析兩組離體胰腺組織代謝物的含量。結(jié)果造模12 h后，胰腺水腫伴出血、實質(zhì)內(nèi)大片凝固性壞死、 間質(zhì)中炎性細胞浸潤，并見胰周脂肪皂化；血清淀粉酶水平為(3527±429)U/L，顯著高于對照組的(1250±188)U/L。波譜分析顯示ANP組胰腺組織的?；撬?Tau)、乙酸(Ace)、丙氨酸(Ala)波峰下面積較對照組顯著增加(P<0.05);甜菜堿(Bet)、磷酸膽堿+甘油磷酸膽堿(Pc+Gpc)含量較對照組降低(P<0.05)；膽堿(Cho)、谷氨酸(Glu)、乳酸(Lac)波峰下面積與對照組無明顯差異。結(jié)論ANP大鼠離體胰腺組織塊具有顯著的代謝特征，為進一步開展人類重癥急性胰腺炎在體波譜研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

胰腺炎，急性壞死性； 磁共振波譜學； 代謝； 精氨酸

磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy，MRS) 分析是用來檢測活體內(nèi)組織代謝與生化指標的無創(chuàng)性技術(shù)。在疾病早期，傳統(tǒng)影像學檢查未見異常時波譜檢查往往能探測出病理反應引起的異常代謝改變[1]。本文采用高場磁共振儀對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠離體胰腺組織塊進行1H MRS分析，檢測代謝物相對含量的改變，以期指導下一步臨床開展在體波譜代謝研究工作。

材料和方法

一、實驗動物及分組

清潔級雄性Wistar大鼠30只，體重200～220 g，由第二軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。Wistar大鼠按完全隨機法分為對照組(10只)及急性壞死性胰腺炎(ANP)組(20只)。ANP組注射20%L-精氨酸溶液2.5 mg/g體重，間隔1 h，重復注射一次。對照組注射等容積生理鹽水。造模后12 h處死各組大鼠，獲取血液、胰腺及肝臟標本。

二、血清淀粉酶檢測

經(jīng)Hitachi 7600-120全自動生化分析儀測定。

三、胰腺組織病理學檢查

常規(guī)行胰腺組織病理學檢查。光鏡下觀察胰腺組織學改變，并參照Czakó等[2]標準從胰腺水腫、出血、壞死、炎細胞浸潤等4個方面進行評分。

四、1H MRS分析

取保存于液氮的對照組及ANP組胰腺組織各8份，經(jīng)重水淋洗后，取15 mg樣品裝入4 mm的附帶球形內(nèi)腔的ZrO2轉(zhuǎn)子，在BRUKER AVANCE-600譜儀上進行分析。1H共振頻率為600.13 MHz。測試用探頭為高分辨魔角旋轉(zhuǎn)頭( High-resolution Magic Angle Spinning，HR-MAS),魔角轉(zhuǎn)速5 kHz，測試溫度300.0 K。譜圖采樣點數(shù)65 K，譜寬20 ppm，馳豫延遲2 s，累加次數(shù)256次，以3.17 ppm膽堿峰定標，均采用預飽和法壓制水峰，并利用CPMG自旋回波壓制大分子及其他一些短T2物質(zhì)的信號。一維1H譜是由預飽和與CPMG兩種實驗方法獲得，CPMG脈沖序列總的自旋回波時間是180 ms。同時，二維J分解實驗、異核單量子相關(guān)譜、TOCSY總相關(guān)譜、COSY相關(guān)譜用來確認1H譜的譜峰指認。由CPMG測得的壓制掉大分子物質(zhì)的一維1H譜數(shù)據(jù)用于主成分分析，得到PC1和PC2的得分圖和負載圖。利用Bruker公司的Topspin 2.1軟件程序?qū)?shù)據(jù)進行相位基線校正，并利用Topspin 2.1軟件對圖譜進行降維簡化處理，同時利用AMIX打包軟件對簡化后的數(shù)據(jù)進行PCA處理，得到相應的得分圖和負載圖。所得譜圖采用機器自帶軟件分析，計算不同化合物波峰下面積。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶水平變化

ANP組血淀粉酶水平為(3527±429)U/L，顯著高于對照組的(1250±188)U/L(P<0.05)。

二、胰腺病理形態(tài)學改變

對照組胰腺無明顯病理改變。ANP組在注射精氨酸1 h后死亡2只，其余大鼠有少量渾濁腹水，大體胰腺組織充血、水腫、出血，并可見黃白色鈣皂斑；光鏡下見腺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，大片壞死組織，胰腺實質(zhì)內(nèi)可見紅細胞，間質(zhì)中見大量炎性細胞浸潤(圖1)。

圖1 對照組(a)和ANP組(b)胰腺病理改變(HE ×200)

三、胰腺組織代謝產(chǎn)物主成分分析及定量測定

對照組及ANP組胰腺組織樣品的HR-MAS1HMRS譜圖見圖2。正常和ANP胰腺樣品處于得分圖的不同區(qū)域(圖3a)。負載圖(圖3b)顯示將正常胰腺、ANP胰腺組織分開的主要代謝產(chǎn)物有：?；撬?Tau)3.45～3.35 ppm、甜菜堿(Bet)3.25～3.20 ppm、磷酸膽堿+甘油磷酸膽堿(Pc+Gpc)3.20～3.18 ppm、乙酸(Ace)1.93～1.80 ppm、丙氨酸(Ala)1.51～1.40 ppm，不能分開的代謝產(chǎn)物有膽堿(Cho)3.18～3.13 ppm、谷氨酸(Glu)2.40～2.28 ppm、乳酸(Lac)1.33～1.22 ppm。以譜圖中3.167的Cho定標，以3.895的Cre為參照，取4.70～0.70為整個積分范圍，通過Bruker公司的Topspin 2.1軟件測量，正常組的Cho、Pc+Gpc、Tau、Bet、Glu、Ace、Ala和Lac的波峰下面積分別為0.44±0.06、1.14±0.45、0.13±0.03、0.73±0.34、0.43±0.05、0.20±0.06、0.23±0.06和0.97±0.41；ANP組分別為0.41±0.13、0.55±0.17、0.25±0.07、0.32±0.09、0.49±0.10、0.30±0.05、0.40±0.10和1.03±0.50。ANP組胰腺組織的Tau、Ace、Ala的波峰下面積較正常組增加(P<0.05);Bet、Pc+Gpc的波峰下面積較正常組減小(P<0.05)； Cho、Glu、Lac的波峰下面積與正常組無明顯差異。

圖2 正常(a)和ANP(b)離體胰腺組織塊的1HMRS譜圖

圖3 由NMR CPMG 1H譜得到的得分圖(a)和負載圖(b)

討 論

臨床診斷ANP常用的方法包括血清淀粉酶檢查及傳統(tǒng)的影像學形態(tài)檢查，這些方法雖具有較高的特異性和敏感性[3-4]，但在極早期的ANP診斷上仍存在一定局限性。

隨著磁共振波譜技術(shù)(MRS)的發(fā)展，高場強的MRI-MRS一體化儀器的問世和MRS靈敏度的不斷提高，MRS在臨床診斷中得到了廣泛地應用[5-6]。由于胰腺解剖位置深在，加上目前臨床上使用的MR機器場強較低(1.5～3.0T),所得到的譜圖分辨率較低，因此，MRS在胰腺疾病上的應用目前還停留在動物實驗上。離體動物胰腺組織可以避免在體檢查時的呼吸偽影干擾，分析條件易于統(tǒng)一控制。本文所采用的HR-MAS的NMR具有直接將胰腺組織置于轉(zhuǎn)子內(nèi)，避免了樣品復雜處理所導致的實驗誤差；因轉(zhuǎn)子體積很小、內(nèi)部為球形，樣品可以100%地保持在檢測線圈內(nèi)；可將樣品磁化率不均勻性降低到最低等優(yōu)點，從而獲得分辨率高、重復性好的圖譜[7]。

本實驗結(jié)果顯示，ANP組胰腺組織的Tau、Ace、Ala含量增加，Bet、Pc+Gpc的含量減少，Cho、Glu、Lac的含量無變化。體內(nèi)Tau能明顯促進神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育和細胞增殖分化、減輕肝臟脂質(zhì)過氧化損傷并能穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細胞滲透壓、調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)定，故ANP大鼠應答性地增加Tau合成，因而含量高于正常組。Ace含量升高，說明ANP時脂肪分解活躍。Gpc和Pc是細胞膜的磷脂代謝重要組分，參與細胞膜的降解與合成，是維持細胞穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的重要組成部分。ANP時因胰腺腺泡壞死嚴重，正常細胞膜合成和分解減少，因此它們的含量降低。Bet是一種季銨型水溶性生物堿，可作為甲基供體，具有促進動物蛋白質(zhì)和脂肪代謝、緩和應激、調(diào)節(jié)滲透壓、增進食欲、穩(wěn)定維生素等作用。人體中Bet主要是從食物中獲取，另外是體內(nèi)Cho轉(zhuǎn)化而來。ANP時大鼠不能從食物中獲取Bet，而大量腺泡細胞壞死，細胞膜生成的Cho降低，導致Bet水平亦隨之減低。

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2010-04-12)

(本文編輯：呂芳萍)

Metabolitefeaturesofacutenecrotizingpancreatitisinrats

TANGWei,LUJian-ping,WANGJian,GONGYan-fang,JIANGFei,WANGYang,MAChao,TIANBing.

DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LUJian-ping,Email:cjr.lujianping@vip.163.com

ObjectiveTo investigate the metabolite features of acute necrotizing pancreatitis in rats in vitro by high resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectroscopy (HR-MASNMR).MethodsA total of 30 Wistar rats were randomized into ANP group (n=20) and control group (n=10). All the rats in ANP group were injected with L-arginine 2.5mg/g body weight twice, and the animals in the control group

same dose of saline. HR MASNMR was used to study the metabolic changes of acute necrotizing pancreatitis in rats in vitro.Results12 hours after the ANP induction, the pancreas were more swelling, presented with bleeding points, with mild increase in liquefied change, coagulation necrosis could be found in parenchyma and a large number of fatty tissues could be seen around the pancreas. Serum amylase level was (3527±429) U/L, which was significantly higher than (1250±188)U/L in control group. Compared with those in the control group, the signal intensity of taurine (Tau), acetic acid (Ace), alanine (Ala) of the ANP group were significantly increased. While the signal intensities of phosphocholine (Pc), glycerophosphocholine (GPc) and betine (Bet) were significantly decreased. The signal intensities of choline (Cho), glutamic acid (Glu), lactate (Lac) were not significantly different.ConclusionsThere were obvious metabolic features of pancreatic tissues of ANP in rats, and it is useful for the application of magnetic resonance spectroscopy in AP in vivo in human studies.

Pancreatitis, acute necrotizing； Magnetic resonance spectroscopy； Metabolism； Arginine

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.010

國家自然科學基金(30870709)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院放射診斷科(湯偉、陸建平、汪劍、田冰)，消化科(龔燕芳、蔣斐)，病理科(王洋)；

華東師范大學光譜學與波譜學教育部重點實驗室(馬超)

陸建平，Email：cjr.lujianping@vip.163.com