磷酸肌酸鈉對(duì)小鼠移植性S180肉瘤生長(zhǎng)的影響△

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(石家莊 050017)

魏素菊 劉凝華 韓文峰

蒽環(huán)類化療藥是腫瘤內(nèi)科應(yīng)用最為普遍的藥物之一,但其明顯的心臟毒性往往不僅影響了其臨床規(guī)范應(yīng)用,同時(shí)也影響了患者的生活質(zhì)量。CP是一種廣泛應(yīng)用于心臟內(nèi)科及心臟外科的一種心肌保護(hù)劑,其作用機(jī)制是為機(jī)體的高耗能細(xì)胞提供能量。但由于腫瘤組織的代謝,該藥物對(duì)腫瘤組織的作用尚不明確故其在腫瘤內(nèi)科的輔助治療中還存在疑慮。本文就通過(guò)磷酸肌酸鈉對(duì)轉(zhuǎn)移性小鼠S180肉瘤的PCNA蛋白及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的測(cè)定從而研究其對(duì)小鼠S180轉(zhuǎn)移瘤的增殖及凋亡的影響。為該藥物在腫瘤輔助治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 主要藥物、試劑與儀器設(shè)備 磷酸肌酸鈉購(gòu)自?？谄媪χ扑幱邢薰?為白色粉末,1.0g/支,批準(zhǔn)文號(hào):H20053431.PCNA。鼠抗人單克隆抗體及羊抗鼠FITC-Ig G二抗試劑盒均為Sanat Cruz公司產(chǎn)品。DAB顯色試劑:河北博海生物工程有限公司產(chǎn)品,鼠抗人單克隆抗體(BCL-2):北京中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品。鼠抗人單克隆抗體(BAX):北京中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品。二抗試劑盒:北京中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品。

2 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 鼠源性 S180肉瘤細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。昆明種雄性小鼠 60只,清潔動(dòng)物,3周齡,體重20～22g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK(冀)2003-1-003。

3 小鼠S180轉(zhuǎn)移瘤造模 無(wú)菌條件下抽取接種7d荷瘤小鼠的腹水,用生理鹽水洗滌 2遍后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,于小鼠右前肢腋下皮下接種,每只 0.2ml。隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組及磷酸肌酸鈉低(4mg/d)、中(8mg/d)、高(16mg/d)劑量組。接種次日開(kāi)始連續(xù)腹腔給藥7d,終止治療后觀察1d,各組動(dòng)物同時(shí)全部處死,取出瘤體并稱重后計(jì)算抑瘤率并分別保存于70%酒精及液氮中。抑瘤率(%)=(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%(公式一)

4 流式細(xì)胞儀測(cè)定 凋亡率的檢測(cè):75%乙醇固定瘤組織,研磨、過(guò)銅網(wǎng)后制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。取 0.1 ml加入碘化丙啶 4℃冰箱避光染色 30 min,500目銅網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)凋亡率。

PCNA蛋白的測(cè)定:將用 70%冷乙醇固定的腫瘤組織用生理鹽水研磨后制成單細(xì)胞懸液,取0.1 ml(細(xì)胞密度為1×106/ml),加入0.1 ml 1∶50稀釋的一抗室溫孵育 30min,加入PBS洗滌 1次,棄上清后加入FITC-IgG二抗工作液100μl,避光、室溫孵育30min。加入PBS離心后棄上清,經(jīng)500目銅網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè),同時(shí)設(shè)有PBS代替一抗和二抗的陰性對(duì)照。PCNA蛋白表達(dá)含量以平均熒光強(qiáng)度(均道值)表示。

均道值=lg(x-Mode)×340(公式二)

5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠腫瘤組織中 BCL-2和BAX蛋白定性表達(dá)

5.1 鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化酶連接(SP)法染色:10%中性甲醛固定腫瘤組織 4～10 h后,梯度乙醇系列脫水,石蠟包埋后4um連續(xù)切片,二甲苯及梯度酒精脫蠟至水,PBS(ph7.4)液浸泡 5min×2,組織抗原微波修復(fù),冷卻,甲醇過(guò)氧化氫修復(fù) 20min,PBS液泡洗5min×2,擦玻片后置于是濕盒中,血清(A液)封閉,溫箱中孵育 45min,滴加一抗,玻片置于濕盒內(nèi)冰箱冷藏過(guò)夜,PBS液 5min×2,加二抗,入溫箱 30min后,PBS液 5min,加三抗,入溫箱 30min后,PBS液 5min×2,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,晾干,中性樹(shù)膠封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗,經(jīng)上述步驟染色,作為陰性對(duì)照。

5.2 結(jié)果判定:Bcl-2和Bax陽(yáng)性表達(dá)均為細(xì)胞胞漿呈棕黃色顆粒狀染色。免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):在切片中隨機(jī)選 5個(gè)高倍視野(400倍),循序在 1000個(gè)細(xì)胞中計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù),并由此得出陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。表達(dá)水平用陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)(Lableling index,LI)表示[11]。LI(%)=(染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) /細(xì)胞數(shù))×100%(公式三)

結(jié) 果

1 各組平均瘤重和抑瘤率,見(jiàn)表1。CP16mg/d組小鼠平均瘤重較對(duì)照組減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但是其余各組間平均瘤重差異不顯著(P＞0.05)。CP16mg/d組抑瘤率為11.60%,CP8mg/d組抑瘤率為6.38%,CP 4mg/d組抑瘤率為4.25%。

表1 不同劑量 CP對(duì)小鼠 S180移植瘤瘤重的影響(n=15,±s)

表1 不同劑量 CP對(duì)小鼠 S180移植瘤瘤重的影響(n=15,±s)

*與對(duì)照組相比,P＜0.05

CP 16mg/d組 80mg/ml 0.2ml 2.22±0.30* 11.60%

2 不同劑量 CP對(duì)小鼠 S180移植瘤組織中細(xì)胞凋亡率的影響:FCM檢測(cè)結(jié)果顯示 CP16mg/d組細(xì)胞凋亡率為13.21±1.15%,高于CP8mg/d組、CP4mg/d組及對(duì)照組但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 不同劑量CP對(duì)小鼠S180移植瘤組織中PCNA蛋白表達(dá)的影響,見(jiàn)表2。不同濃度CP組 PCNA蛋白的表達(dá)均低于對(duì)照組,較對(duì)照組相比 CP16mg/d組差異有顯著性(P＜0.05),而CP4mg/d和CP8mg/d差異不明顯(P＞0.05)。

表2 不同劑量CP對(duì)小鼠 S180移植瘤組織中PCNA蛋白表達(dá)的影響(n=15,±s)

表2 不同劑量CP對(duì)小鼠 S180移植瘤組織中PCNA蛋白表達(dá)的影響(n=15,±s)

*與對(duì)照組相比,P＜0.05

CP 16mg/d組 313.39±7.04*

4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示:Bcl-2和Bax蛋白均以細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒狀染色的細(xì)胞為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。結(jié)果顯示隨著 CP劑量的增加Bcl-2的表達(dá)及Bax的均有減弱趨勢(shì)。Bcl-2/Bax在CP16mg/d組(0.31±0.11%)最低,CP8mg/d組(0.31±0.09%)、CP4mg/d組(0.32±0.12%)與對(duì)照組(0.34±0.13%)比較也呈降低趨勢(shì),但各組間的差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。

討 論

隨著新藥物的應(yīng)用,目前惡性腫瘤的治療前景已有了很大的改觀。但隨之而來(lái)的是化療藥物的毒副作用,有時(shí)它甚至超過(guò)治療本身的作用。磷酸肌酸(Phosphocrentine,Pcr)是參與細(xì)胞能量代謝的重要物質(zhì)之一,在細(xì)胞中的含量可達(dá) 2～30 mmol/L,它的主要生理功能在于補(bǔ)充體內(nèi)高耗能細(xì)胞內(nèi)的消耗的ATP,同時(shí) CP能夠抑制細(xì)胞膜上5’-核苷酸酶的活性,穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)腺苷酸含量,從而為細(xì)胞內(nèi)能量代謝創(chuàng)造條件。目前已廣泛應(yīng)用于各種心臟疾病的治療[1,2]。為了研究 CP應(yīng)用于化療心臟毒性的預(yù)防及治療同時(shí)其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響,設(shè)計(jì)并作了如上實(shí)驗(yàn),通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)小鼠 S180移植瘤組織中 PCNA蛋白的表達(dá)及應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分析小鼠 S180移植瘤組織中Bcl-2和Bax的表達(dá)來(lái)研究CP對(duì)小鼠S180移植瘤生長(zhǎng)的影響。

PCNA是一種 36k D的核蛋白,是 DNA多聚酶的輔助蛋白,存在于細(xì)胞核內(nèi)不同部位,是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。PCNA在細(xì)胞的G1晚期表達(dá)增加,在 S期達(dá)高峰,然后下降[3,4]。檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá),可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng) CP治療后 PCNA蛋白表達(dá)降低,以 CP 16mg/d劑量組為最佳,與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05),而 CP4mg/d和CP8mg/d與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說(shuō)明高劑量的CP抑制腫瘤生長(zhǎng)與抑制小鼠 S180移植瘤組織中 PCNA蛋白的表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控是一個(gè)十分復(fù)雜的多基因作用過(guò)程,在這一基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,Bcl-2基因家族起關(guān)鍵作用。目前已知Bcl-2家族成員包括:Bcl-2/Bax、Bcl-XL/Bcl-Xs、Bak等,它們相互作用,參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡,其中以 Bcl-2/Bax的作用尤為重要。Bcl-2家族可以分為兩類:一類是抗細(xì)胞凋亡基因,代表基因是 Bcl-2基因,其主要生物學(xué)功能為延長(zhǎng)細(xì)胞生命并增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡刺激因素的抗性;另一類是促細(xì)胞凋亡基因,代表基因是 Bax基因,其促進(jìn)凋亡主要通過(guò)拮抗Bcl-2的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)。Bcl-2、Bax均可形成自身同源二聚體或與對(duì)方形成異源二聚體,并以二聚體形式參與細(xì)胞凋亡的過(guò)程。若 Bcl-2同聚體形成則抑制細(xì)胞凋亡,而 Bax同聚體形成則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但當(dāng)Bcl-2和Bax形成異二聚體復(fù)合物時(shí)則抑制 Bcl-2的抗凋亡功能。因而認(rèn)為Bcl-2和Bax之間的比值決定了細(xì)胞是否接受誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)[6～10]。本研究發(fā)現(xiàn) CP給藥組小鼠 S180移植瘤組織中Bcl-2/Bax比值無(wú)明顯變化,說(shuō)明不同濃度的CP對(duì)小鼠 S180移植瘤細(xì)胞的凋亡無(wú)影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì) CP治療后小鼠 S180移植瘤的研究發(fā)現(xiàn),治療量的CP不影響小鼠 S180移植瘤的生長(zhǎng),而高劑量的CP可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此為磷酸肌酸應(yīng)用于腫瘤的輔助治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 張 彬,趙 宏.磷酸肌酸的心肌保護(hù)機(jī)制及其在心臟疾病中的應(yīng)用.醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(02):262-263.

[2] Poniatovaskii IM,Zelenin AV,Emelianov SV,etal.The influence of induced severe myocardial ischemia on coronary disease course[J].Voen Med Zh,2005,326(10):16-21.

[3] Li FH,Jiang HG,Zhao YG,etal.Expression and significance of PCNA,P53 protein and Survivin in gastric epithelial dysplasia with colonic and small intestinal metaplasia.China Journal of Modern Medicine,2007,17(3):279-281.

[4] Wildemann B,Schmidmaier G,Ordel S,etal.Cell proliferation and differentiation during fracture healing are influencedby locally applied IGF-I and TGF-beta1:Comparison oftwo proliferation markers,PCNA and Brd U.JBiomed Mater Res,2003,65B(1):150-6.

[5] 宋楠萌,桑建利,徐 恒.增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的分子結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展.自然科學(xué)進(jìn)展,2006,10(16):1201.

[6] Tsukaharas S,Yamamoto S,Shew TT,etal.Inhalation of low-level formal-dehyde increases the bcl-2 /bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice[J].Neuroimmunomodulation,2006,13(2):63-8.

[7] Tsukaharas S,Yamamoto S,Shew TT,etal.Inhalation of low-level formadehyde increases the bcl-2 /bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice[J].Neuroimmunomodulation,2006,13(2):63-8.

[8] Chang SF,Sun YY,YangLY,etal.Bcl-2 gene family expression in thebrain of rat offspring after gestational and lactational dioxin exposure[J].Ann N Y Acad Sc,2005,1042:471-80.