急性血糖波動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞核因子κB及其抑制因子IκB表達(dá)的影響△

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科(沈陽(yáng) 110004)

趙 晟 張 微 李 艷 韓 萍*

糖尿病心肌病變(DM)是由糖尿病高血糖狀態(tài)所導(dǎo)致的一種心臟疾病[1]。氧化應(yīng)激是所有糖尿病并發(fā)癥損害發(fā)生的主要因素[2],有證據(jù)顯示急性的血糖波動(dòng)可以導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[3]。本研究采用給Wistar雄性大鼠間斷或持續(xù)地靜脈輸注50%葡萄糖溶液建立急性血糖波動(dòng)或持續(xù)性動(dòng)物模型,探討血糖波動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取7周健康雄性Wistar大鼠18只,體重250～280g,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,清潔度Ⅰ級(jí),隨機(jī)被分為3組,分別為對(duì)照組、血糖波動(dòng)組、持續(xù)高血糖組,常規(guī)飼料自由飲水,溫度 22±1℃,濕度 50%左右,明 /暗周期為12h。

1.2 主要試劑:兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體、兔抗大鼠 IκB多克隆抗體免疫組化 SABC染色試劑盒,均購(gòu)自武漢博士德公司。血清MAD、SOD檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立血糖波動(dòng)動(dòng)物模型:大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 3～5d后,將導(dǎo)管分別植入右頸內(nèi)靜脈用于輸液和左頸動(dòng)脈用于采血。術(shù)后3d,進(jìn)行輸液。分別予對(duì)照組 0.9%生理鹽水,使血糖維持在 5mmol/L左右;予血糖波動(dòng)組 50%葡萄糖注射液間斷輸注,使血糖在5mmol/L與20mmol/L之間波動(dòng),每 2h變動(dòng)血糖值,持續(xù)2h,見表1。予持續(xù)高血糖組50%葡萄糖注射液持續(xù)輸注,使血糖維持在20mmol/L左右。每小時(shí)檢測(cè)血糖,所有實(shí)驗(yàn)大鼠輸液時(shí)間在48h。

2.2 標(biāo)本采集:輸注相應(yīng)液體 48h后,取血 5ml,3000轉(zhuǎn) /分離心 15min,取上清于-70℃保存?zhèn)溆谩Ｕ∽笮氖倚募?置于4%含 0.1%DEPC的多聚甲醛中固定。

2.3 指標(biāo)檢測(cè):①血清指標(biāo):用比色法法測(cè)定血清MDA、SOD;血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖(BIOSEN5030,德國(guó))。②觀察心肌細(xì)胞內(nèi) NF-κB及IκB表達(dá):用免疫組化的方法測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi) NF-κB、IκB。

2.4 結(jié)果判定:利用 Axioplan 2 imaging顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定 NF-κB、IκB陽(yáng)性著色面積(%)和平均吸光度,以陽(yáng)性著色面積×平均吸光度計(jì)算NF-κB在細(xì)胞核中的相對(duì)表達(dá)量,IκB在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1 對(duì)照組、血糖波動(dòng)組、持續(xù)性高血糖組血糖測(cè)定值,見表1,表2。

表1 血糖波動(dòng)組高峰平臺(tái)期血糖值與對(duì)照組、持續(xù)性高血糖組同時(shí)相血糖值的比較(±s)

表1 血糖波動(dòng)組高峰平臺(tái)期血糖值與對(duì)照組、持續(xù)性高血糖組同時(shí)相血糖值的比較(±s)

持續(xù)高血糖組 20.1±14 21.5±4.1 21.3±0.2 19.6±1.6 20.1±1.0 21.7±2.3 19.9±0.3 19.4±1.6 20.7±3.2 19.7±1.6 21.9±2.0 20.7±3.0

表2 血糖波動(dòng)組低谷平臺(tái)期血糖值與對(duì)照組、持續(xù)性高血糖組同時(shí)相血糖值的比較(±s)

表2 血糖波動(dòng)組低谷平臺(tái)期血糖值與對(duì)照組、持續(xù)性高血糖組同時(shí)相血糖值的比較(±s)

血糖波動(dòng)組 5.6±0.3 5.0±4..3 6.3.±1.4 4.7±2.0 4.9±1.9 5.7±4.4 4.9±0.7 5.4±3.1 4.2±0.7 5.7±3.2 6.0±2.0 4.7±3.6持續(xù)高血糖組 19.6±3.0 20.1±5.9 21.5±1.2 18.4±4.6 22.1±5.12 0.7±3.2 18.7±1.3 23.5±5.6 20.2±4.8 20.1±3.6 18.0±7.0 22.9±1.0

2 血清 MDA、SOD表達(dá)水平,見表3。血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組血清中 MDA、SOD表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),而且血糖波動(dòng)組血清中 MDA、MDA/SOD比值均高于持續(xù)性高血糖組(P＜0.01);血糖波動(dòng)組MDA/SOD比值顯著高于對(duì)照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.01),持續(xù)性高血糖組 MDA/SOD比值高于對(duì)照組但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表3 對(duì)照組、血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組血清 MDA(nmol/ml)、SOD(U/ml)水平

血糖波動(dòng)組、持續(xù)性高血糖組心肌細(xì)胞核內(nèi) NF-κB、IκB的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),血糖波動(dòng)組與持續(xù)性高血糖組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);血糖波動(dòng)組、持續(xù)性高血糖組心肌細(xì)胞的NF-κB/IκB明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),血糖波動(dòng)組心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NF-κB/IκB比值低于持續(xù)性高血糖組,但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

3 心肌細(xì)胞內(nèi) NF-κB、IκB及NF-κB/IκB比值表達(dá),見表4。

表4 對(duì)照組、血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組血清MDA、SOD水平

討 論

NF-κB是一種具有多向性的轉(zhuǎn)錄因子,能被多種物質(zhì)刺激激活。NF-κB蛋白 N-末端具有 Rel蛋白同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain,RHD),該結(jié)構(gòu)域是NF-κB二聚化的活性位點(diǎn)、與定位細(xì)胞核 DNA結(jié)合位點(diǎn)和IκB相互作用位點(diǎn),蛋白 C末端擁有 IκB特征性結(jié)構(gòu)域-錨蛋白重復(fù)序列[3,4]。當(dāng)細(xì)胞未受到外界刺激時(shí),IκB與NF-κB結(jié)合形成復(fù)合體,存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi);當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)如細(xì)胞因子等,細(xì)胞質(zhì)中的IκB激酶(IκB kinase,IKK)發(fā)生積聚并被激活,活化的IKK能使 IκB磷酸化,之后 IκB與NF-κB分離,并被降解,同時(shí)NF-κB被激活,而進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)炎癥因子如細(xì)胞間粘附因子(Intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)等基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

本研究對(duì) Wistar大鼠心肌細(xì)胞的研究過程中,發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組的心肌細(xì)胞核NF-κB表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。此外,發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)組及持續(xù)性高血糖組大鼠血清中MDA、MDA/SOD的水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而血糖波動(dòng)組表達(dá)又顯著高于持續(xù)性高血糖組(P＜0.01),反映血糖波動(dòng)和持續(xù)性高血糖都能誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),而且血糖波動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激的作用更強(qiáng)。血糖波動(dòng)和持續(xù)性高血糖通過誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)雄性Wistar大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),激活心肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB,從而入核表達(dá)。Osorio-Fuentealba C等[5,6]在缺氧的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)活性氧簇(Reactive oxidative species,ROS)明顯升高,ROS激活了NF-κB,啟動(dòng)介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

NF-κB作為典型的多向性轉(zhuǎn)錄因子,在許多的免疫應(yīng)答反映的信號(hào)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。NF-κB能被多種刺激如細(xì)胞因子等激活,活化的NF-κB介導(dǎo)多種促炎癥的細(xì)胞因子和粘附分子的表達(dá)和合成[7]。心肌細(xì)胞內(nèi) NF-κB細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能非常復(fù)雜,除促進(jìn)促炎癥的細(xì)胞因子的表達(dá)外,NF-κB還能激活其他多種基因的表達(dá),繼而影響心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、收縮、死亡及細(xì)胞外基質(zhì)重塑等病理生理過程[8]。

近年來研究顯示,NF-κB活化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric-oxide synthase,iNOS)表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增加作用[9]。而大量ROS的蓄積可激活 JNK介導(dǎo)的線粒體依賴性細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10～12]。糖尿病心肌細(xì)胞存在明顯的凋亡現(xiàn)象,而影響凋亡的原因之一就是高糖。本研究發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)能導(dǎo)致機(jī)體 ROS增多及心肌細(xì)胞內(nèi) NF-κB激活,后者激活可導(dǎo)致炎癥因子進(jìn)一步表達(dá),可能是糖尿病時(shí)血糖波動(dòng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損害的主要病理生理機(jī)制之一。

[1] Sharma V,McNeill JH.Diabetic cardiomyopathy:where are we 40 years later?Can JCardiol,2006,22:305-308.

[2] Shichiri M,Kishikawa H,Ohkubo Y,etal.Long-term results of the kumamoto study on optimal diabetes control in type 2 diabetic patients.Diabetes Care,2000,23(Suppl.2):B21-B29.

[3] Keith D Brown,Estefania Claudio,Ulrich Siebenlist.The roles of the classical and alternative nuclear factor-B pathways: potential implications for autoimmunity and rheumatoid arthritis.Arthritis Research& Therapy,2008,10:212-226.

[4] 何 冰,趙 晟,張 巍,等.水楊酸鈉對(duì)大鼠脂肪組織炎癥因子表達(dá)的影響,陜西醫(yī)學(xué)雜志,2009,3:267-269.

[5] Osorio-Fuentealba C,Valdes JA,Riquelme D,etal.Hypoxia stimulates via separate pathways erk phosphorylation and NF-κappaB activation in skeletal muscle cells in primary culture.JAppl Physiol,2009,29:[Epub ahead of print.

[6] Wang F,Kaur S,Cavin LG,etal.Nuclear-factorkappaB(NF-κappaB)and radical oxygen species play contrary roles in transforming growth factor-beta1(TGF-beta1)-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma(HCC)cells.Biochem Biophys Res Commun,2008,377(4):1107-12.

[7] Annika Linde,Derek Mosier,Frank Blech,etal.Innate immunity and inflammation-new f rontiers in comparative cardiovascular patholμgy.Cardiovascular Research,2007,73:26-36.

[8] Jones WK,Brown M,Ren X,etal.NF-κappaB as an integrator of diverse signaling pathways: the heart of myocardial signaling?Cardiovasc Toxicol,2003,3:229-254.

[9] Sakon S,Xue X,Takekawa M,etal.NF-κBinhibits TNF-induced accumulation of ROS that mediate prolonged MAPK activation and necrotic cell death.EMBO J,2003,22:3898-3909.

[10] Ventura JJ,Cogswell P,Flavell RA,etal.JNK potentiates TNF-stimulated necrosis by increasing the production of cytotoxic reactive oxygen species,2004,18:2905-2915.

[11] Pham CG,Bubici C,Zazzeroni F,etal.Ferritin heavy chain upregulation by NF-κB inhibits TNFa-induced apoptosis by suppressing reactive oxygen species,Cell,2004,119:529-542.

[12] Kamata H,Honda S,Maeda S,etal.Reactive oxygen species promote TNFa-induced death and sustained JNK activation by inhibiting MAPkinase phosphatases.2005,120:649-661.