馬皰疹病毒gD蛋白主要抗原域的表達(dá)及初步應(yīng)用

時(shí)成龍,侯玉杰,相文華,郭 巍,李紅梅,趙立平,何劍斌

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧沈陽110161;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江哈爾濱150001)

馬皰疹病毒 1型和4型是馬鼻肺炎的病原,EHV-1主要導(dǎo)致妊娠馬流產(chǎn),還可引起呼吸道癥狀、馬駒死亡和神經(jīng)癥狀;EHV-4主要導(dǎo)致呼吸道癥狀,偶爾可引起流產(chǎn)。該病在全世界廣泛分布,并對(duì)所有年齡和種類的馬以及其他馬屬動(dòng)物的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。1980年我國殷震、劉景華等人從東北兩個(gè)馬場(chǎng)的流產(chǎn)胎兒首次分離到馬鼻肺炎病毒[1]。目前國際上檢測(cè)該病的方法有很多,但國內(nèi)對(duì)ELISA檢測(cè)EHV抗體的報(bào)道很少[2-3],關(guān)于EHV分子生物學(xué)的研究也不多。本研究克隆EHV-1/4 gD基因同源性高且抗原性強(qiáng)的C端序列,并進(jìn)行原核表達(dá)及純化,對(duì)重組pET-gD蛋白進(jìn)行免疫原性鑒定,為馬鼻肺炎的檢測(cè)工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 馬皰疹病毒1型438/77株、馬皰疹病毒4型405/76株、馬胎皮膚細(xì)胞、EHV-1/4高免兔血清、DH5α、BL21及 pET-30a均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬病研究中心保存。MEM及胎牛血清購自Gibco。H is-Tag M onoclonal Antibody、Anti-M ouse IgG、A nti-Rabbit IgG、A ntihorse IgG購自Sigma公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上的EHV-1/4基因序列,應(yīng)用DNAStar軟件分析gD蛋白的抗原性及同源性,設(shè)計(jì)一對(duì)抗原性強(qiáng)且同源性較高的引物。GF ：5′-GGA TCCATGCGGATTGTTACT -3′(Bam H Ⅰ);GR ：5′-GGTCGACTTACGGGTCTGTTT-3′(SalⅠ)

1.3 病毒增殖 將EHV-1接種長(zhǎng)成單層的馬胎皮膚細(xì)胞上,吸附40min后加入含4%血清的維持液,置于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。出現(xiàn)80%以上細(xì)胞病變時(shí)收毒,-70℃保存。

1.4 EHV-1 gD基因主要抗原區(qū)編碼基因的擴(kuò)增取250μL病毒,按Omega公司試劑盒操作說明提取病毒DNA,-20℃保存。取5μL EHV-1 DNA作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增,退火溫度54℃,時(shí)間40 s,30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳鑒定并經(jīng)膠回收試劑盒回收。

1.5 表達(dá)載體pET-gD的構(gòu)建 將PCR膠回收產(chǎn)物與pET-30a質(zhì)粒分別用Bam HⅠ和Sa lⅠ雙酶切并回收目的片段,T4 DNA連接酶16℃過夜連接,轉(zhuǎn)化至DH 5α,37℃培養(yǎng)12 h后,從 LB平板(50 μg/mL Kan)上挑單菌落,接種于 LB培養(yǎng)基(50 μg/mL Kan),37℃震蕩培養(yǎng) 12 h,保存菌種,提取質(zhì)粒用Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定,將鑒定結(jié)果為陽性的菌種送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。選取測(cè)序結(jié)果與目的片段序列相一致的陽性質(zhì)粒并命名為pET-gD,并將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)感受態(tài)BL21(DE3)。

1.6 陽性轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)鑒定 將陽性轉(zhuǎn)化菌接種于含LB培養(yǎng)基(50μg/mL Kan)中37℃震蕩過夜培養(yǎng)。次日以1%量接種于5mL LB培養(yǎng)基(50μg/mL Kan)中37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)分別加入 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mmo l/L 的 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),在誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h和過夜分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

超聲波處理后經(jīng)SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜,4℃封閉過夜,次日分別加入首抗His-Tag M onoclonal Antibody,二抗 Anti-Mouse IgG。用 Western blot超敏發(fā)光液顯色。

1.7 蛋白表達(dá)形式鑒定及蛋白純化 將陽性轉(zhuǎn)化菌接種于50mL LB培養(yǎng)基(50μg/mL Kan)中培養(yǎng),OD值約為0.6時(shí)開始誘導(dǎo)表達(dá),4 h后收獲菌體細(xì)胞,用5mL 1×PBS重懸,超聲波處理細(xì)胞重懸液至清亮,4 000 r/min(4℃)離心10min,分別收獲沉淀和上清液,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白的存在形式。

切下目的條帶并研磨[4],浸于1 mL蛋白浸出液中4℃過夜,次日回收液體,SDS-PAGE鑒定并用BCA方法測(cè)定蛋白含量。

1.8 重組蛋白抗原性的鑒定 分別用本實(shí)驗(yàn)室已制備的兔抗EHV-1/4高免血清為首抗,Anti-Rabbit IgG為二抗,Western blot以鑒定純化蛋白的反應(yīng)原性。

1.9 間接ELISA檢測(cè) 使用純化后的重組pET-gD蛋白1μg/mL濃度包被,4℃過夜。次日洗滌后用含5%脫脂乳的PBS 37℃封閉2h,將待檢馬血清按1∶100稀釋,每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣,37℃作用1 h,洗滌后將Anti-horse IgG 1∶10 000稀釋加入并37℃作用1 h。再洗滌加入含0.4 mg/mL OPD的底物緩沖液,避光顯色15 min,加入H2SO4終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

1.10 臨床樣品檢測(cè) 利用本試驗(yàn)初步建立的馬鼻肺炎間接ELISA方法對(duì)全國不同地區(qū)的383份馬血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。初步調(diào)查了全國部分地區(qū)馬鼻肺炎的感染情況。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定 提取EHV-1病毒總DNA,應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增出大小為685 bp的片段。

挑取表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菌落,振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,應(yīng)用Bam HⅠ和Sa lⅠ酶切鑒定。結(jié)果表明目的片段已經(jīng)插入pET-30a載體中。

2.2 陽性轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)優(yōu)化及純化 不同時(shí)間和不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果表明,時(shí)間從2 h到過夜和IPTG濃度從0.2～1.0 mmol/L均可有效誘導(dǎo)目的蛋白,但以 IPTG0.8 mmol/L誘導(dǎo)4h的效果最佳(圖1、圖2)。表達(dá)產(chǎn)物的大小約為35 kDa,與預(yù)期蛋白分子量一致,占總菌體蛋白含量約為55%。在最佳條件下進(jìn)行大量誘導(dǎo),超聲破碎后收集上清及沉淀,SDS-PAGE表明重組蛋白為包涵體形式,并進(jìn)行切膠純化(圖3)。

圖1 0.8 mmol/L ITPG濃度時(shí)不同時(shí)間誘導(dǎo)蛋白表達(dá)

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測(cè) 純化后的pET-gD融合蛋白分別與兔抗EHV-1/4陽性血清反應(yīng)后,均在35 kDa處出現(xiàn)特異性條帶(圖 4),Western blot結(jié)果表明,純化后的該蛋白具有反應(yīng)原性。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的間接ELISA檢測(cè) 間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,重組的pET-gD蛋白能到與EHV馬陽性血清發(fā)生反應(yīng),而不與健康馬血清、EAV馬陽性血清、JEV馬陽性血清、EIV馬陽性血清發(fā)生反應(yīng)(圖5)。

2.5 全國各地區(qū)馬鼻肺炎的檢測(cè) 應(yīng)用本試驗(yàn)表達(dá)的蛋白初步建立的間接ELISA診斷方法對(duì)全國部分地區(qū)的馬鼻肺炎樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,383份馬血清樣本中83份血清的馬鼻肺炎抗體呈陽性,血清陽性率為21.67%(見表1)。

圖5 間接ELISA分析純化的重組pET-gD蛋白

表1 全國部分地區(qū)馬鼻肺炎的感染情況

3 討論

EHV-1/4大多數(shù)糖蛋白鑲嵌在病毒囊膜上,作為纖突蛋白突出于病毒粒子表面。是誘發(fā)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要病毒蛋白[5],其中5個(gè)糖蛋白(gB、C、D、H 、L)上含有重要的病毒中和表位,在感染馬內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)EHV-1/4的抗病毒血清學(xué)反應(yīng),而gD誘導(dǎo)的保護(hù)反應(yīng)最為強(qiáng)烈[5-6]。本試驗(yàn)選取目的片段為EHV-1/4 gD基因主要抗原區(qū)域C端序列,而且具有非常高的同源性。構(gòu)建的陽性克隆pET-gD表達(dá)產(chǎn)物用Western blot進(jìn)行抗原性分析,兔抗 EHV-1、EHV-4高免血清均能與EHV-1 gD基因表達(dá)的產(chǎn)物反應(yīng),結(jié)果表明,EHV-1 gD基因C端的原核表達(dá)產(chǎn)物具有EHV-1、EHV-4型共同抗原。說明了 EHV-1 gD原核表達(dá)產(chǎn)物可作為ELISA包被抗原。利用重組pET-gD蛋白建立的ELISA與病毒中和試驗(yàn)具有非常高的符合率[2]。Doll E R和Bryans JT(1962)等認(rèn)為病毒中和抗體可維持6～12個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間,因此應(yīng)用EHVgD-ELISA可檢出較高的陽性率[7]。

2010年,在我國舉行亞運(yùn)會(huì),農(nóng)業(yè)部對(duì)賽馬引進(jìn)及本地馬匹血清學(xué)檢測(cè)工作非常重視。目前,國際上已有重組蛋白建立的間接和單抗阻斷ELISA技術(shù),用來檢測(cè)和區(qū)分EHV-1和EHV-4血清型的產(chǎn)品[7-9],但進(jìn)口試劑盒價(jià)格過于昂貴,所以我國自主研發(fā)檢測(cè)方法也正在進(jìn)行中。本試驗(yàn)為我們進(jìn)一步開發(fā)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的能檢測(cè)和區(qū)分EHV-1/4的ELISA試劑盒提供了充分的基礎(chǔ)[9-10]。

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