Taq Man探針熒光定量RT-PCR對牛精液中牛病毒性腹瀉病毒檢測方法的建立

季新成,段曉東,劉 菲,劉小蘭,于學輝,曾新強

(新疆出入境檢驗檢疫局,新疆烏魯木齊830063)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea,BVD),又稱黏膜病,是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起牛的一種病毒性傳染病,該病世界范圍內(nèi)廣泛分布,給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,牛精液中可攜帶BVD病毒,其在人工授精技術中的廣泛應用是將該病毒傳播給未感染牛群及地區(qū)的重要途徑[1-2]。進口牛精液是國內(nèi)引進優(yōu)良品種的重要途徑之一,隨著國際貿(mào)易的頻繁及人工繁殖技術的不斷發(fā)展,我國進口牛精液的數(shù)量將不斷增多,進一步加大了該病的傳播風險,所以對牛精液中該病毒的檢測對于防止該病的傳播尤為重要。對于牛精液中BVDV的檢測,RT-PCR方法具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點,但精液及其凍存液中抑制RT-PCR擴增成分的存在,導致檢測靈敏度偏低,或操作程序復雜[3]。本研究對新鮮牛精液和牛精液凍存液中抑制 RT-PCR擴增的因素進行了分析,并對該成分的去除方法進行了研究,通過核酸提取和反應條件的優(yōu)化建立了牛精液中BVDV熒光定量RT-PCR快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、樣品和菌種 BVDV C24V弱毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,由新疆出入境檢驗檢疫局技術中心傳代保存,測得毒價為10-5.5TCID50/50μL,牛精液、全血、血清等樣品采自新疆種牛場。

1.2 主要儀器與試劑 高速冷凍離心機、ABI7300熒光PCR儀;Trizol(invitrogen),M-MULV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑為 Promega(上海)產(chǎn)品,引物、Taq Man探針等均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物、探針的設計與合成 利用Primer 2.0引物、探針設計軟件,根據(jù)標準毒株NADL5′UTR保守區(qū)設計特異性引物Bp1和Br1,序列分別為：5′-GTGGTGAGTTCGTTGGATGG-3′和 5′-CCGCTCAGGTTAAGATGTG C-3′,探針 Bpro,序列為：5′-FAM-CGAACCACTGACGACTACCCTGTACTCA-TAMRA-3′。

1.4 病毒RNA的提取 細胞培養(yǎng)物、組織、血液等樣品按Trizol試劑操作說明書進行。精液樣品用Sephacryl S-400(Phamasia產(chǎn)品)凝膠過濾后提取(取600μL乙醇保存的Sephacryl S-400凝膠加入1 mL容積的凝膠過濾柱,用約3 mL p H值5.3的醋酸鈉溶液洗滌后,加入200μL精液,1 000 r/min離心2 min,取100μL精液過濾液,加1 000μL Trizol提取核酸)。提取的核酸溶于40μL無RNA酶的去離子水中,置4℃2 h內(nèi)使用。

1.5 熒光RT-PCR擴增條件的優(yōu)化 采用矩陣法對反應體系中d NTP、Mg2+、引物、探針濃度和循環(huán)參數(shù)等進行優(yōu)化。

1.6 方法的特異性、重復性檢測 用該擴增體系分別對牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛白血病病毒(BLV)、藍舌病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、古典豬瘟病毒(CSFV)等核酸樣品進行了擴增。對病毒含量為1 000 TCID50、100 TCID50和10TCID50的精液進行3次重復檢測,對不同試驗獲得的Ct值標準差和變異系數(shù)進行分析。

1.7 方法的靈敏度檢測

1.7.1 與病毒分離方法的比較 將病毒含量為105TCID50/50μL的BVD病毒液并分別用MEM、新鮮牛精液和牛凍存精液進行101～107系列稀釋,取100μL用本研究建立的熒光定量RT-PCR方法檢測。熒光 RT-PCR以出現(xiàn)S型擴增曲線,Ct＜45,且陰性對照和空白對照均沒有擴增曲線和Ct值作為陽性判定標準,將呈陽性反應的最高稀釋度換算成TCID50單位,每個反應均做重復檢測,計算Ct值的平均值。病毒分離用含2%胎牛血清的MEM將每一稀釋度的精液再進行10倍系列稀釋,同文獻[4]進行檢測,以出現(xiàn)細胞病變(CPE)的最高稀釋倍數(shù)作為病毒分離檢測的靈敏度。

1.7.2 與普通RT-PCR的比較 將上述系列稀釋的病毒中提取的RNA用文獻[5]的引物進行 MMULV一步法RT-PCR擴增,以呈陽性反應的最高稀釋度作為檢測靈敏度。

1.8 對臨床樣品的檢測 對從同一牛場6個月內(nèi)采集的120份牛新鮮精液和40份凍存牛精液(來源于85頭公牛,部分為不同時間收集),用該方法進行病毒檢測。并對上述精液按文獻[4]用病毒分離法同步進行了病毒分離檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光 RT-PCR反應條件的優(yōu)化 優(yōu)化后的25μL反應體系中,Mg2+2.5 mmol/L,dNTP各0.2 mmol/L,上下游引物各 0.4 mmol/L,探針0.2 mmol/L,Taq酶1.25 U,M-MULV 100 U,RNAseinhibator 10 U,模板 10μL,擴增條件為 50℃,2 min;92℃,10 min;92℃10 s,60℃30 s,45個循環(huán)。

2.2 方法的特異性和重復性 用該擴增體系對IBRV、BLV、BTV、FMDV、CSFV 核酸樣品檢測均為陰性。對病毒含量為1 000 TCID50、100 TCID50和10TCID50的精液進行3次重復檢測,不同試驗獲得的Ct值變異系數(shù)為1.63～2.24,表明該方法具有很好的特異性和重復性。

2.3 方法的檢測靈敏度比較 對用不同成分系列稀釋后的病毒進行檢測,結(jié)果表明,該熒光RT-PCR方法可檢測到新鮮精液和凍存精液中106稀釋梯度的病毒,相當于 0.0125 TCID50的病毒,僅比用MEM稀釋后的檢測靈敏度低10倍。病毒分離對上述3種成分稀釋后的病毒分別檢測到105、103和104的稀釋梯度,換算后分別相當于0.25 TCID50、25TCID50和2.5 TCID50的病毒,結(jié)果見表1。

表1 熒光RT-PCR和病毒分離法對新鮮精液和凍存精液檢測比較

2.4 對精液樣品的檢測 對120份牛新鮮精液和40份凍存牛精液用該熒光RT-PCR沒有檢測到陽性樣品,用病毒分離法也沒有檢測到陽性樣品。

3 討論

關于采用熒光 RT-PCR方法對牛精液中BVDV的檢測,國內(nèi)外尚未見報道。鑒于牛精液及其凍存精液中抑制熒光RT-PCR擴增成分的存在,本研究在采集新鮮牛精液降溫延伸后,向其中添加已知量的病毒,作為測試樣品,用卵黃、甘油、果糖、青霉素/鏈霉素配制精液凍存液,用分別去除了上述成分之一的凍存精液和已知BVDV陰性的新鮮牛精液按1∶6對病毒進行稀釋,用Trizol提取病毒核酸后進行擴增,發(fā)現(xiàn)新鮮牛精液本身對熒光 RTPCR擴增具有抑制性,凍存精液中的卵黃是抑制熒光RT-PCR擴增的主要成分,因卵黃中過多蛋白成分的存在,抑制了DNA聚合酶的活性,經(jīng)Sephycral S-400凝膠對精液過濾處理,去除了卵黃中特異性抑制因子。經(jīng)Sephycral S-400凝膠過濾處理后的精液用 TRIzol提取病毒核酸,針對BVDV 5′UTR保守區(qū)基因序列設計特異性引物和熒光探針,通過反應條件的優(yōu)化,建立了從牛精液中直接檢測BVDV的熒光RT-PCR方法。結(jié)果表明,該方法具有較好的敏感性、特異性和可重復性,且操作簡單。Givens M D等[6]用RT-nPCR方法檢測自然感染牛精液中的病毒,其結(jié)果與Da Silva N[7]等人工向精液中添加病毒的檢測效果一致。向已知陰性的精液中添加已知量的病毒,可精確定量,便于檢測靈敏度的確定。

據(jù)報道,有些持續(xù)性感染牛不產(chǎn)生血清抗體,但從公牛精液中可分離到病毒,病毒在公牛生殖道復制,污染精液但逃避抗體檢測[1-2],有些牛血清病毒抗體呈現(xiàn)陽性后,中和了精液中的病毒,用病毒分離方法不能分離到病毒,但用RT-nPCR方法可檢測到病毒核酸[8-9]。本研究用該熒光RT-PCR方法對120份新鮮牛精液和40份凍存牛精液檢測,均沒有檢測到陽性樣品,有報道表明,BVDV持續(xù)感染但非病毒血癥?；駼VDV急性感染牛精液中可分泌病毒[1],但精液中能否檢測到病毒還可能與病毒在睪丸中的特定循環(huán)路徑、病毒暴露特性、初次感染病毒時牛的年齡、機體的免疫耐受以及穩(wěn)定的血睪屏障等因素有關[6],我們對所檢測的公牛同步進行了BVDV血清抗體檢測,基本都呈現(xiàn)抗體陽性,是否也可以表明,BVDV血清抗體陽性牛精液中不攜帶病毒,該研究還有待于進一步確證。

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