剛地弓形蟲蛋白質(zhì)分揀定位與功能研究概述

趙世云,計永勝,孫希萌,索 勛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193)

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲,可以感染包括人在內(nèi)的所有溫血動物的有核細胞。如今,剛地弓形蟲病已成為影響公共衛(wèi)生的重要的人畜共患?。菏澜缛巳旱膭偟毓蜗x慢性感染率約為25%,在法國和巴西,人的剛地弓形蟲血清陽性率甚至高達75%～80%,我國各地人群弓形蟲感染率從0.13%到47.13%不等。剛地弓形蟲具備精密而復(fù)雜的細胞入侵、細胞內(nèi)分裂和逸出機制。在這3個過程中,剛地弓形蟲的各種蛋白質(zhì)起著舉足輕重的作用。因此,剛地弓形蟲的蛋白質(zhì)合成、分揀和分泌機制逐漸成為寄生蟲學(xué)研究的熱點之一。這些研究既可以更好的揭示剛地弓形蟲的致病機理,又可以為其他寄生蟲研究,如瘧原蟲,提供理論上的借鑒。本文主要闡述的是剛地弓形蟲蟲體內(nèi)外蛋白質(zhì)的分揀與分泌定位研究進展。

1 剛地弓形蟲蟲體內(nèi)蛋白分揀機制研究進展

對弓形蟲體內(nèi)蛋白早期分泌路徑進行分析后發(fā)現(xiàn),弓形蟲對組成型及調(diào)節(jié)蛋白分泌的分揀機制與高等真核細胞具有多重類似點[1]。定位到微線、棒狀體和致密顆粒3種細胞器中的蛋白質(zhì)經(jīng)核糖體合成后都要通過信號肽識別進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng),并在高爾基體完成加工修飾,最終定位到蟲體的不同部位。研究發(fā)現(xiàn),GPI-錨定的蛋白(如SAGs)通過組成型分泌小泡靶向運輸?shù)较x體細胞膜;微線蛋白則可能受酪氨酸胞漿信號基序的介導(dǎo)從反-高爾基體網(wǎng)中得以分揀,并在鈣離子信號刺激下釋放后固定于蟲體表面;棒狀體蛋白主要儲存于非成熟棒狀體(類似真核生物中非成熟分泌顆粒,經(jīng)加工修飾后成為成熟棒狀體),通過管道釋放,最終定位于帶蟲空泡膜;致密顆粒蛋白的釋放可能是通過致密顆粒表面蛋白與蟲體胞膜蛋白的融合。釋放出的致密顆粒蛋白多呈可溶性,分布于帶蟲空泡腔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和帶蟲空泡膜。這些剛地弓形蟲體內(nèi)蛋白不同定向是由蛋白自身攜帶的次級信號肽決定的。對棒狀體蛋白ROP1的研究就證明,ROP1的蛋白前體片段對它向棒狀體的定位起著決定性作用[2]。而對于致密顆粒蛋白GRA5來說,其N端序列則決定著它向致密顆粒定位的命運。

2 剛地弓形蟲蟲體外蛋白定位機制研究進展

我們知道,剛地弓形蟲入侵細胞只需要不到30 s的時間。縱然在這一瞬間,剛地弓形蟲的蛋白釋放同樣具有時序性：微線首先在蟲體與宿主細胞接觸時釋放微線蛋白形成活動連接體,使蟲體與宿主細胞緊密結(jié)合,最近研究表明,棒狀體頸蛋白(RON)也參與活動連接體的形成;隨后是棒狀體蛋白(ROPs)的釋放,這些蛋白最終對帶蟲空泡膜進行修飾;最后釋放的是致密顆粒蛋白(GRAs),它們既可以保持原有的可溶狀態(tài),也可以對帶蟲空泡膜及帶蟲空泡腔內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進行修飾。剛地弓形蟲主要蛋白及定位功能見表1。

弓形蟲蛋白質(zhì)在宿主細胞的定位機制目前存在不同的解釋模型。一說弓形蟲在入侵到宿主細胞的瞬間會將某些蛋白質(zhì),尤其是棒狀體蛋白注入到宿主細胞漿中,同時形成一個不含蟲體的空泡結(jié)構(gòu)(evacuoles)。與帶蟲空泡相似,這種泡狀結(jié)構(gòu)同樣可以募集宿主的細胞器,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。隨著弓形蟲的進一步入侵,這種泡狀結(jié)構(gòu)逐漸與帶蟲空泡表面融合,使先前存在于宿主胞漿的弓形蟲蛋白定位到帶蟲空泡表面[3]。有研究也證明,在入侵過程中,弓形蟲會將致密顆粒蛋白GRA7在帶蟲空泡形成前以絲狀或者念珠狀形式分泌到宿主細胞,同時,這種蛋白還可以和棒狀體蛋白 ROP2和 ROP4相互結(jié)合[4]。所以,從某種意義上講,剛地弓形蟲在入侵宿主細胞時只是暫時將自身蛋白釋放到宿主細胞漿,最后還是要將這些蛋白招募回來供自己使用。這樣既可以避免被宿主細胞的免疫遞呈系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),也可以保持自身活力。然而,最近的研究也發(fā)現(xiàn),剛地弓形蟲同樣可以“大膽”地將蛋白持續(xù)釋放到宿主的細胞漿。典型的例子就是Toxofilin蛋白,該蛋白可以與宿主細胞肌動蛋白結(jié)合[5],在弓形蟲入侵細胞32 h后仍存在于宿主細胞漿中,但敲除該基因并不影響弓形蟲正常生物學(xué)特性[6]。除此之外,剛地弓形蟲甚至可以將自身蛋白分泌定位到宿主細胞的細胞核中,例如蛋白磷酸酶 2C(PP2C-hn)[7]和rop16[8]。兩者均具有核定位基序,前者可以與Toxofilin結(jié)合,并將 Toxofilin帶到宿主細胞核。但奇怪的是,PP2C-hn的敲除只是對剛地弓形蟲的生長產(chǎn)生微弱的影響。Toxofilin和PP2C-hn的具體功能還需要進一步研究。

剛地弓形蟲入侵細胞后會形成一個帶蟲空泡,限制了蟲體與宿主之間蛋白信息的交換,因為這層膜結(jié)構(gòu)僅允許不大于1 300 Da的蛋白自由穿過。迄今為止,帶蟲空泡膜的具體形成機制仍需要確鑿試驗數(shù)據(jù)闡明,帶蟲空泡膜表面蛋白的定位機制也是科學(xué)家的研究重點之一。有報道,在GRA5[9]和GRA6[10]的定位中,其N端氨基酸序列起著決定性的作用。ROP18蛋白也能牢固地定位于帶蟲空泡膜,同樣其接近N端的氨基酸序列對其定位有重要作用。尋找影響蛋白質(zhì)定位的保守氨基酸序列將有助于更清晰地闡明蟲體外蛋白的分泌機理。

表1 剛地弓形蟲主要蛋白及其功能

3 剛地弓形蟲蟲蛋白功能研究進展

近些年,許多研究小組在分析弓形蟲蛋白分泌、定位的基礎(chǔ)上,把研究重點轉(zhuǎn)移到棒狀體(ROPs)和致密顆粒蛋白(GRAs)的功能上。其中,ROP2蛋白家族是多種棒狀體分泌蛋白的集合。其家族成員ROP2可以募集宿主細胞的線粒體到帶蟲空泡膜表面,可以參與蟲體向宿主攫取營養(yǎng)物質(zhì)的過程。研究還證明,Ⅰ、Ⅲ型弓形蟲在某些棒狀體蛋白分泌上存在差異,較為經(jīng)典的是ROP18和 ROP16蛋白。Ⅰ型弓形蟲的ROP18的分泌量遠大于Ⅲ型弓形蟲,蟲體雜交試驗、基因組數(shù)量特征座分析及轉(zhuǎn)基因弓形蟲試驗聯(lián)合證明ROP18可提高蟲體的增殖分裂速度及對感染動物的致死作用,是弓形蟲的一種毒力因子[11]。近年研究發(fā)現(xiàn),具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化活性的ROP18可以將ROP2與ROP8蛋白磷酸化,并發(fā)生自身磷酸化[12]。但這種分布于帶蟲空泡膜的蛋白質(zhì)對宿主細胞的生物學(xué)影響仍有待研究。另一種具有磷酸化功能的ROP2蛋白家族成員是ROP16。Ⅱ型弓形蟲的ROP16基因序列與Ⅰ型、Ⅲ型存在較大差異(后兩者可認為相同)。這種差異直接造成不同型弓形蟲感染對宿主細胞細胞因子IL-12分泌的影響不同。有數(shù)據(jù)顯示,II型弓形蟲感染的人包皮纖維母細胞(HFF)IL-12分泌量大大高于另外兩型[8]。這種影響是通過ROP16干涉宿主細胞STAT3信號傳導(dǎo)實現(xiàn)的,但詳細作用機制仍需進一步研究闡明。科學(xué)家從GRA6、GRA4和ROP7上找到了針對BALB/c小鼠H-2Ld限制性CD8+T細胞的抗原表位[13-14]。有科研人員也從tgd057蛋白上找到了針對H-2Kb組織相容復(fù)合體限制性抗原表位[15]。

4 結(jié)語與展望

剛地弓形蟲作為一種重要的人畜共患病,一直受到科研人員的重視。一個世紀以來,科學(xué)家從分類形態(tài)學(xué)、診斷學(xué)、治療學(xué)及分子生物學(xué)等方面對弓形蟲作了研究[16]。然而,一些挑戰(zhàn),尤其是分子生物學(xué)方面的難題仍然擺在大家面前：弓形蟲入侵宿主細胞的蛋白質(zhì)基礎(chǔ),包括受體的分類與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo),這將很好的解釋為何剛地弓形蟲可以感染所有有核細胞;棒狀體蛋白不同定位的內(nèi)在機制,這種分揀完成與帶蟲空泡形成的時間先后及棒狀體蛋白的跨膜運輸機制仍需詳細闡明;3種特殊細胞器中蛋白質(zhì)的抗原性存在差異,這有助于弓形蟲優(yōu)勢抗原的篩選;弓形蟲與宿主細胞的對話機制,可能更好的解釋弓形蟲的免疫逃避機制,為研發(fā)更加有效的弓形蟲病治療藥物提供理論基礎(chǔ)。因此,隨著新理論、新技術(shù)的不斷涌現(xiàn),剛地弓形蟲的研究必然會取得更加好的成果。

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