鴉膽子提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)NO-cGMP轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的影響

程富勝,胡振英,辛蕊華,羅永江,董鵬程

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730050)

鴉膽子味苦,性寒,有毒,傳統(tǒng)上治療休息痢和瘧疾等,現(xiàn)代藥理研究證實(shí)鴉膽子具有殺滅阿米巴原蟲、抗瘧、抗寄生蟲、抗腫瘤、降低血壓等作用[1]。一氧化氮(NO)的基本生物學(xué)作用之一是在細(xì)胞間信息交換中起作用。研究表明,是NO作用于靶細(xì)胞并在鳥苷酸環(huán)化酶(GC)的作用下產(chǎn)生的主要第二信使,進(jìn)而環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)通過下游許多分子發(fā)揮NO的作用[2]。NO的作用方式獨(dú)特,它代表一類新的細(xì)胞信使分子,是“氣體性、親脂性”的,這種特性與NO可能具有的廣泛生物學(xué)功能有很大的相關(guān)性。資料表明,L-Arg-NO-cGMP通路在人類和動(dòng)物多種組織和細(xì)胞中廣泛存在,它代表著一種細(xì)胞間信息傳遞和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的新的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制[3]。本試驗(yàn)通過研究鴉膽子提取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞內(nèi)NO、cGMP含量的變化,分析了鴉膽子提取物對(duì)NO-cGMP信號(hào)系統(tǒng)的影響,為研究鴉膽子抗寄生蟲提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥物 鴉膽子提取由課題組提取、分離、純化。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠,體重18～22 g,雄性,健康;由甘肅省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 主要儀器和試劑 RPMI-1640粉劑(Gibco),cGMP放射免疫試劑盒購(gòu)自上海醫(yī)科大學(xué),Griess試劑、1 mmol/L NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液為國(guó)產(chǎn)分析純。島津UV-3000紫外可見光分光光度計(jì),智能放免γ-測(cè)量?jī)x(SN-695B型,上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠)。

1.4 應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn),進(jìn)行差異性比較。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 按照脾淋巴細(xì)胞的提取方法[4]進(jìn)行細(xì)胞懸液的制備,用臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞的測(cè)定,使活細(xì)胞數(shù)大于95%,調(diào)節(jié)細(xì)胞的濃度為5×106個(gè)/mL,分裝于培養(yǎng)瓶,試驗(yàn)分5個(gè)組,即為空白對(duì)照組(為提取的淋巴細(xì)胞),藥物組(鴉膽子提取物濃度依次為 80μg/mL、120μg/mL、240 μg/mL),每組加脾淋巴細(xì)胞懸液3 mL,鴉膽子提取物按所需量加入,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育4 h、8 h、12 h、24 h后。按照試驗(yàn)要求分別收集不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞及其上清液,備用。

2.2 細(xì)胞內(nèi)cGMP的測(cè)定 將備用細(xì)胞,調(diào)節(jié)濃度為1×106個(gè)/mL。取 1 mL,1 500 r/min離心5 min,棄去上清液,細(xì)胞沉淀加1 mL 50 mmol/L的醋酸緩沖液(pH值4.75),混懸,反復(fù)凍融細(xì)胞3～4次,3 000 r/min離心15 min,取上清液100μL按照試劑盒操作說明書進(jìn)行測(cè)定。

2.3 細(xì)胞內(nèi)一氧化氮含量的測(cè)定(Griess法)[5]在p H值7.5～8.1條件下,溶液中的NO2-可與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化,再與N-(1-萘基)-乙二胺偶聯(lián),生成紫紅色產(chǎn)物,該產(chǎn)物在550 nm存在較大吸收峰。將其在550 nm比色,吸光度值的大小與NO2-的含量或一氧化氮(NO)的產(chǎn)量成正比,據(jù)此可檢測(cè)NO的生成量。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn),取 0、5、10、25、50、100、160、200、250 μmol/L 濃度梯度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。

2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)4 h、8 h、12 h、24 h后,收集細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min,取上清液在550 nm處讀取吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中NO2-的含量。

3 結(jié)果

3.1 鴉膽子提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi) cGMP的影響 見表1。

濃度為50μg/mL和100μg/mL的鴉膽子提取物組8 h和24 h細(xì)胞內(nèi)cGMP的含量較高,200 μg/mL藥物組在12 h開始下降,與空白無差異性。

3.2 鴉膽子提取物提高脾淋巴細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮含量結(jié)果 見表2。

在表2中,隨著鴉膽子提取物濃度的遞增,細(xì)胞產(chǎn)生的NO的含量在遞增,而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞產(chǎn)生的NO的含量也在遞增,在時(shí)間與濃度雙因素作用下,細(xì)胞產(chǎn)生的NO的含量均呈正相關(guān)。

表1 鴉膽子提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)cGMP的影響 (pg/10 m L)

表2 鴉膽子提取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 (μmol/L)

4 討論

環(huán)核苷酸是重要的細(xì)胞內(nèi)信使物質(zhì),它們參與調(diào)控各種激素、神經(jīng)遞質(zhì)等所導(dǎo)致的各種生命活動(dòng)。cGMP是三磷酸鳥苷(GTP)在鳥苷酸環(huán)化酶(GC)作用下水解產(chǎn)生的。NO也可以通過激活鳥苷酸環(huán)化酶,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) cGMP增加[6]。最新的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中存在NO-cGMP通路[7]。NO-cGMP是細(xì)胞內(nèi)NO和cGMP相互作用的機(jī)制之一,為了考察鴉膽子提取物對(duì)兩者的作用,不僅要從單方面研究,而且更重要的是要結(jié)合NO-cGMP這一系統(tǒng)機(jī)制進(jìn)行研究。

從鴉膽子提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)NO影響結(jié)果看,鴉膽子提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生具有明顯的調(diào)節(jié)作用,不論從培養(yǎng)時(shí)間還是藥物濃度方面,鴉膽子提取物具有雙因子調(diào)節(jié)功能,并呈時(shí)間和濃度的正相關(guān)關(guān)系。NO可以通過廣泛的信號(hào)途徑來實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié),如NO通過MAPK途徑啟動(dòng)不同的信號(hào)通路,改變機(jī)體相應(yīng)的功能[8];cGMP是NO作用于細(xì)胞的主要信號(hào)通路[9],低濃度的NO作用于可溶性鳥苷酸環(huán)化酶,升高胞間的cGMP,介導(dǎo)PDES,離子通道和蛋白激酶G發(fā)揮其相應(yīng)的生理作用[10]。雖然細(xì)胞中NO含量在試驗(yàn)中隨著濃度和時(shí)間在遞增,但存在著一定的活性范圍。本試驗(yàn)提示應(yīng)以cGMP的水平來確定影響NO產(chǎn)生的鴉膽子提取物的濃度。

[1] 楊峰,于紅,王鳳禮.鴉膽子的研究概況[J].黑龍江醫(yī)藥,1998,11(2)：112-113.

[2] Baltrons M A,Pedraza C,Sardon T,et al.Regulation of NO-dependent cyclic GMP formation by inflammatory agents in neural cells[J].Toxicol Lett,2003,139(2-3)：191-198.

[3] Richard G,Mmowles,Moncade.Nitricoxide synthase[J].Sin Biochem,1999,298：249-256.

[4] 朱立平,陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2003.

[5] 龐戰(zhàn)軍,周玫,陳瑗.自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2000.

[6] Broner C W,O′Dorisio M S,Rosenberg R B,et al.Cyclicnucleotide and vaso activein test in alpeptidep roduction in a rabbit modle of Escherich in coli septicemia[J].Am J Med Sci,1995,309(5)：267-277.

[7] 臧夢(mèng)維,劉景生.NO-cGMP信息通路在阿片類藥物耐受和依賴中的調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1999,15(2)：106-111.

[8] Beck K F,Eberhardt W,Frank S,etal.Inducible nitric oxide synthase：Role in cellular signalling[J].J Exp Biol,1999,202(Pt 6)：645-653.

[9] Schmidt H H.NO,CO and OH Endogenous soluble guanylyl cyclase-activating factors[J].FEBS Lett,1992,307：102-107.

[10]Lincoln T M,Cornwell T L.Intracellular cyclic GMP receptor proteins[J].FASEB J,1993,7(2)：328-338.