納米硒對昆明系小鼠的急性毒性及蓄積毒性試驗

王 光,王利華,朱連勤

(青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山東青島266109)

納米紅色元素硒是以蛋白質(zhì)為分散劑的元素硒的納米粒子。納米粒子有不同于宏觀和微觀物質(zhì)的特性,納米紅色元素硒粒子中的硒原子比灰色和黑色元素硒有更活潑的化學性質(zhì)。高學云[1]用粒徑在60 nm以內(nèi)的納米硒進行試驗,急性毒性試驗表明,以口服硒元素的量計,納米紅色元素硒的 LD50為112.98(89.95～141.90)mg/kg體重,顯示出納米紅色元素硒的低毒性。不同粒度的納米硒具有不同的尺寸效應(yīng),因此不同粒度的納米硒的毒性不盡相同,作為一種新型的硒源,應(yīng)充分了解其毒性的基礎(chǔ)上才能應(yīng)用于生產(chǎn)。本試驗用昆明系小鼠,研究100 nm納米硒的LD50、蓄積系數(shù)K,為安全使用納米硒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 納米硒的含量為97%以上,直徑為100 nm,單分散,無團聚,由山東科技大學惠贈。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng) 昆明系小鼠購于青島市實驗動物和動物實驗中心,生產(chǎn)許可證號為Scxk(魯)20030010。體重18～22g,雌雄各半,專用的鼠盒飼養(yǎng),盒底鋪設(shè)墊料,每3 d更換1次。試驗期內(nèi)自由采食、自由飲水(蒸餾水),采用自然光照,室溫26℃～30℃。

1.3 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)成分 參考NRC(1974)及GB14924-94配制成純合日糧見表1。

表1 試驗用小鼠基礎(chǔ)日糧

1.4 試驗方法 半數(shù)致死量(LD50)的測定采用改良寇氏法。18～22 g體重的昆明系小鼠50只隨機分為5組,每組10只,雌雄各半,分籠飼養(yǎng),按 0.2 mL/10 g體重限量,一次灌胃,灌注劑量分別為482.04mg ?kg-1、303.94 mg ?kg-1、191.64 mg?kg-1、120.83 mg?kg-1、76.19 mg?kg-1(該劑量是根據(jù)預試驗得到的100%致死量為最高值,按組距等比遞減得到的)。灌胃給藥前禁食12 h、禁水2 h,灌胃后2 h復食,觀察時間為14 d。

在半數(shù)致死量的測定結(jié)果基礎(chǔ)上,采用固定劑量染毒法進行蓄積試驗。另取20只健康小鼠,隨機分為2組,每組10只,雌雄各半,分籠飼養(yǎng)。按0.2 mL/10 g體重為限量,第1組每鼠每日灌注0.25%羧甲基纖維素溶液;第2組每鼠每日灌服納米硒1/5 LD50,連續(xù)25 d。

1.5 檢測指標 在急性毒理學試驗中,觀察小鼠中毒癥狀及出現(xiàn)時間。對死亡的小鼠進行剖檢,觀察心、肝、脾、肺、腎及胃腸的病理變化,取樣用 Bouin固定液并制成組織切片,顯微鏡下觀察并記錄病理組織學變化。每天稱重投料量,次日投料前回稱剩料,記錄每組小鼠每天的采食量。根據(jù)小鼠死亡情況采用改良寇氏公式計算LD50。在蓄積試驗中,確定蓄積系數(shù)K,并在灌注25 d后做屠宰試驗,稱量體重及心、肝、肺、脾、腎器官重,并計算內(nèi)臟器官指數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 應(yīng)用Excel 2003,進行數(shù)據(jù)的整理與分析,并采用SAS軟件中的Glm過程進行方差分析,然后用Duncan氏SSR進行多重比較,檢驗誤差為5%水平。

2 試驗結(jié)果

2.1 小鼠半致死量 根據(jù)表2記錄小鼠死亡率可計算出,LD50(小鼠)為303.94 mg/kg,其95%可信限為276.75～391.66 mg/kg。

表2 小鼠灌胃給藥急性毒試驗結(jié)果

2.2 小鼠的采食量變化 各組小鼠平均日采食量變化見圖1。

圖1 急性澆灌后小鼠的采食量

1組的小鼠在灌注后24 h內(nèi)的死亡率為100%,因此,沒有采食量的記錄。2組、3組小鼠采食量的變化趨勢相同,即在灌胃后的第1天采食量達到最低,此后逐漸恢復,灌胃后第4天有所下降然后升高。4組、5組小鼠采食量變化趨勢大致相同,灌注后采食量逐漸升高,在灌注后第3天出現(xiàn)反彈,之后采食量升高直至正常。

2.3 小鼠中毒癥狀 中毒小鼠呼吸窘迫,運動失調(diào),個別小鼠表現(xiàn)為躥行,食欲廢絕。死亡小鼠的肛門周圍有黃色分泌物。小鼠中毒死亡時間很短,在灌注后1 h內(nèi)開始出現(xiàn)死亡,48 h后無死亡小鼠。對中毒小鼠進行剖檢可見,肝臟有明顯的出血;死亡時間拖長的小鼠除肝臟外,心臟及肺臟也偶見有出血,腎臟及脾臟未見異常。

2.4 組織學檢查 鏡檢的結(jié)果見中插彩版圖2,與正常的組織相比(見中插彩版圖3)可見中插肝小葉組織破壞嚴重,結(jié)構(gòu)紊亂,肝細胞氣球樣變性嚴重,壞死較嚴重,肝竇顯著減小,中央靜脈嚴重淤血。肺間質(zhì)顯著增生,肺泡壁顯著增厚,肺泡腔明顯減小,破裂嚴重,上皮局灶性壞死。胃小凹處上皮細胞壞死嚴重,形成局部潰瘍灶樣病灶。局部腸上皮細胞壞死嚴重,紋狀緣缺失。心肌纖維紊亂,橫紋不清,局部肌纖維斷裂、壞死、溶解。

2.5 蓄積系數(shù)K 1/5LD50固定劑量灌注25 d后小鼠的死亡率。因為累計灌注劑量已達到5LD50,而小鼠的死亡率未達到50%,按規(guī)定停止試驗,可判斷納米硒的蓄積系數(shù)K＞5,屬輕度蓄積。

2.6 納米硒對內(nèi)臟器官指數(shù)的影響 小鼠的內(nèi)臟器官指數(shù)見表3。納米硒的灌注組與羧甲基纖維素灌注組間各內(nèi)臟指數(shù)無顯著差異(P＞0.05)。對腎臟指數(shù)的影響在統(tǒng)計上沒有達到顯著水平,但影響較大(P=0.0792)。性別對脾臟指數(shù)的影響顯著(P＜0.05),同組雄鼠的脾臟指數(shù)均有大于雌鼠的趨勢。

表3 25 d 1/5LD50灌注后小鼠內(nèi)臟器官重及內(nèi)臟器官指數(shù)

3 討論

本試驗通過昆明系小鼠急性試驗得到的納米硒LD50為303.94 mg/kg體重(276.75～391.66 mg/kg體重),蓄積試驗得到的蓄積系數(shù)K＞5。而亞硒酸鈉的 LD50為 15.72(13.38～18.47)mg/kg體重[1],在雛雞體內(nèi)的蓄積系數(shù)為2.58。本試驗的急性毒性試驗和蓄積毒性試驗均表現(xiàn)出了納米硒的低毒性。Zhang J S等[2]體外研究證實,納米硒與GSH的反應(yīng)速率僅僅是亞硒酸鈉與GSH反應(yīng)速率的1/12.3,這可能是納米硒毒性較低的機制之一。

本試驗所得到的LD50與以往的報道差異較大。王華麗[3]小鼠急性毒性試驗表明,納米硒的LD50值為92.1 mg Se/kg體重,95%的可信限為71.1～131.1 mg Se/kg體重,與高學云[1]報道的相近。造成差異的原因可能是納米硒尺寸效應(yīng)的結(jié)果,不同的反應(yīng)體系可生成不同粒度的納米硒,不同粒度的納米硒具有不同的理化特性。小粒度的納米硒可均勻分散于水,本試驗所用的納米硒粒度為100 nm左右,納米硒易沉淀,顆粒分布不勻,因此試驗中無法用水作為納米硒溶劑而采用0.25%羧甲基纖維素作為懸浮劑,通過增加溶劑的黏度降低納米硒的沉降速度,以保證納米硒在溶劑中分布均勻。納米硒不溶于水,在某種程度上也會減少了機體對硒的吸收,而降低了納米硒的毒性,在作為添加劑使用時更安全。另外,硒中毒除了硒的形式、動物種類、性別,以及營養(yǎng)因素等影響因素[4],年齡也有很大的影響,本試驗采用是機體成熟小鼠,機體代謝相對生長鼠要慢,對納米硒毒性耐受能力較強,因此而表現(xiàn)出輕度的蓄積。

不同給藥方式及不同的動物對硒的毒性的反應(yīng)不同。本試驗小鼠的中毒死亡時間集中在48 h之內(nèi)。肉仔雞通過飼料攝入硒的中毒癥狀會在3至4 d后出現(xiàn)[5]。從急性灌注后小鼠采食量變化可以推斷,納米硒對小鼠一次性非致死量的損傷可在5 d后恢復正常。雖然在灌注2 d后采食量有升高但可以認為是灌胃應(yīng)激的恢復,5 d之后采食量的恢復正常意味著機體損傷得到恢復。

[1] 高學云,張勁松,張立德.納米紅色元素硒對小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J].中國公共衛(wèi)生,2000,16(5)：421-422.

[2] Zhang J S,Gao X Y,Zhang L D,et al.Biological effects of nano red elemental selenium[J].Bio Factors,2001,15：27-38.

[3] 王華麗.納米硒的生物利用和毒性研究[D].北京：中國科學技術(shù)大學博士學位論文,2007.

[4] Combsg F IR,Combss B.The Role of Selenium in Nutrition[J].British Journal of Nutrition,1986,502-508.

[5] Surai P F.Selenium in poultry nutrition2.Reproduction,egg and meat quality and practical applications[J].World's Poultry Science Journal,2002,58：431-451.