中藥蟾酥免疫增強劑對肉仔雞免疫器官生長發(fā)育及免疫活性細胞的影響

李敬雙,于 洋,唐雨順,張玉科,李 明,李 敏,田莉莉

(遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州121001)

為解決目前肉仔雞免疫效果差、發(fā)病率高以及化藥免疫增強劑存在毒副作用和殘留等問題,我們應(yīng)用中藥蟾酥,依據(jù)現(xiàn)代中醫(yī)中藥理論,科學(xué)組合,研制開發(fā)了中藥蟾酥免疫增強劑,在實踐應(yīng)用中取得了較好的效果。為進一步闡明它增強免疫作用的機制,本試驗對肉仔雞飼料中添加中藥蟾酥免疫增強劑后,免疫器官的生長發(fā)育情況以及免疫器官中T淋巴細胞和漿細胞的變化情況進行了觀察,結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 1日齡AA健康肉仔雞200羽,購自遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物飼養(yǎng)中心。

1.1.2 藥物 中藥蟾酥免疫增強劑,由本課題組提供。

1.1.3 雞馬立克氏病液氮疫苗(凍克靈Rispens)

凍克靈疫苗系Rispens CVI988株馬立克氏病液氮疫苗,由南京梅里亞動物保健有限公司生產(chǎn)。批號：09R0390。

1.1.4 試劑 4%多聚甲醛固定液,副品紅溶液,六偶氮副品紅溶液,α-醋酸萘酯溶液,反應(yīng)液,甲基綠染色液,甲基綠-派洛寧染液本實驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 將1日齡AA健康肉仔雞200羽隨機分為兩組,每組100羽,統(tǒng)一飼喂相同質(zhì)量的全價飼料,1日齡頸部皮下注射凍克靈Rispens,每羽0.2 mL。第一組雛雞分別于第1周(1～7日齡)和第3周(15～21日齡)于飼料中添加0.5%中藥蟾酥免疫增強劑。第二組雛雞作為空白對照。其余管理措施兩組完全一致。

1.2.2 免疫器官生長發(fā)育情況的測定 兩組雛雞分別于14日齡和28日齡,各隨機抽取發(fā)育正常的20羽個體,空腹稱重,按常規(guī)方法屠宰,分離胸腺、腔上囊和脾臟,用濾紙吸去表面水分后,電子天平稱量濕重。指數(shù)測定,臟器指數(shù) =免疫器官重量(mg)/體重(g)×100%。

1.2.3 免疫器官中T淋巴細胞和漿細胞數(shù)的檢測 免疫器官中T淋巴細胞數(shù)的檢測 兩組雛雞分別于14日齡和28日齡無菌采樣,各隨機采取20羽雛雞胸腺、腔上囊和脾臟的特定部位,固定于4%多聚甲醛,丙酮脫水,石蠟切片,分別進行α-醋酸萘酯酶法(ANAE)染色和甲基綠-派洛寧細胞化學(xué)染色法(PMG)染色,油鏡觀察相應(yīng)區(qū)域單位面積(10 mm2)中T淋巴細胞和漿細胞的數(shù)量[1]。

1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)間差異的顯著性采用SPSS 13.0軟件中的t檢驗,比較處理組與空白對照組的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 中藥蟾酥免疫增強劑對免疫器官生長發(fā)育的影響

2.1.1 對胸腺生長發(fā)育的影響 在14日齡和28日齡添加中藥蟾酥免疫增強劑組試驗肉仔雞胸腺的重量和指數(shù)均高于空白對照組,其中在14日齡時重量和指數(shù)均差異顯著,(P＜0.05)。在28日齡時重量差異顯著(P＜0.05),見表1。

2.1.2 對腔上囊生長發(fā)育的影響 在14日齡和28日齡,添加中藥蟾酥免疫增強劑組試驗肉仔雞腔上囊的重量和指數(shù)高于空白對照組,其中在14日齡時重量和指數(shù)均差異顯著(P＜0.05),在28日齡時重量差異顯著(P＜0.05),見表1。

2.1.3 對脾臟生長發(fā)育的影響 在14日齡和28日齡添加中藥蟾酥免疫增強劑組試驗肉仔雞脾臟的重量與指數(shù)均高于空白對照組,其中在14日齡時重量和指數(shù)均差異顯著(P＜0.05),在28日齡時重量差異顯著(P＜0.05),見表1。

2.2 中藥蟾酥免疫增強劑對免疫器官中免疫活性細胞的的影響14日齡和28日齡,添加中藥蟾酥免疫增強劑組試驗肉仔雞胸腺中 T淋巴細胞和漿細胞的數(shù)量均明顯高于空白對照組,其中中藥蟾酥免疫增強劑組在14日齡時胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)中的T淋巴細胞數(shù)、髓質(zhì)中的漿細胞數(shù)和對照差異顯著(P＜0.05),結(jié)果見表2。

2.2.2 對腔上囊中T淋巴細胞和漿細胞數(shù)的影響在14日齡和28日齡,添加中藥蟾酥免疫增強劑組試驗肉仔雞腔上囊淋巴濾泡中T淋巴細胞和漿細胞的數(shù)量均明顯高于空白對照組,其中中藥蟾酥免疫增強劑組在14日齡和28日齡腔上囊淋巴濾泡皮質(zhì)和髓質(zhì)中的漿細胞均和對照組差異顯著(P＜0.05),在28日齡皮質(zhì)中的淋巴細胞數(shù)和對照組差異顯著(P＜0.05),結(jié)果見表2。

2.2.3 對脾臟中T淋巴細胞和漿細胞數(shù)的影響在14日齡和28日齡,添加中藥蟾酥免疫增強劑組試驗肉仔雞脾臟中T淋巴細胞和漿細胞的數(shù)量均明顯高于空白對照組,其中在14日齡時脾臟紅髓中的漿細胞數(shù)和動脈周圍淋巴鞘中的 T淋巴細胞數(shù)和對照組比較差異顯著(P＜0.05)。在 28日齡時動脈周圍鞘中的漿細胞數(shù)和T淋巴細胞數(shù),紅髓中的漿細胞數(shù)和對照組差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

表1 中藥蟾酥免疫增強劑對免疫器官生長發(fā)育的影響

表2 中藥蟾酥免疫增強劑對免疫器官中T淋巴細胞和漿細胞數(shù)的影響

3 討論

3.1 在本試驗中,添加中藥蟾酥免疫增強劑組雛雞胸腺、腔上囊和脾臟等免疫器官的重量和指數(shù)均明顯高于空白對照組,其中在14日齡時兩組間3大免疫器官和重量及胸腺和脾臟的指數(shù)均差異顯著(P＜0.05)。在28日齡時兩組間3大免疫器官的重量及腔上囊的指數(shù)差異顯著(P＜0.05)。免疫器官重量的增加是生長發(fā)育快的表現(xiàn),而指數(shù)的提高意味著免疫系統(tǒng)成熟較快[2],說明在正常飼料中添加中藥蟾酥免疫增強劑,可促進肉仔雞免疫器官的生長發(fā)育和迅速成熟,從而使肉仔雞整體免疫機能加強,抵抗各種病原微生物感染和抗各種應(yīng)激的能力得到提高。

3.2 在本試驗中,添加中藥蟾酥免疫增強劑組肉仔雞胸腺、腔上囊和脾臟中的T淋巴細胞和漿細胞數(shù)均明顯高于空白對照組,其中在14日齡時,免疫增強劑組胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)中的T淋巴細胞數(shù)、脾臟動脈周圍鞘的T淋巴細胞數(shù)和空白對照組差異顯著(P＜0.05);腔上囊皮質(zhì)和髓質(zhì)的漿細胞數(shù)、胸腺髓質(zhì)和脾臟紅髓的漿細胞數(shù)和空白對照組差異顯著(P＜0.05)。在28日齡時,免疫增強劑組胸腺髓質(zhì),腔上囊皮質(zhì)及脾臟動脈周圍鞘T淋巴細胞和對照組差異顯著(P＜0.05);腔上囊皮質(zhì)和髓質(zhì)的漿細胞數(shù)及脾臟紅髓和動脈周圍鞘中的細胞數(shù)和對照組差異顯著(P＜0.05)。本試驗所用中藥蟾酥免疫增強劑可明顯促進免疫器官中免疫活性細胞的增殖,提高機體細胞免疫和體液免疫的機能[3-4]。

3.3 通過應(yīng)用整體或離體的試驗方法和不同核細胞、淋巴細胞及其亞群、自身抗體、細胞因子等多方面的指標,從不同的側(cè)面揭示了蟾酥及其有效成分對免疫系統(tǒng)的保護作用。通過溶血空斑形成細胞(PFC)試驗,E-花環(huán)形成細胞(ERFC)試驗,聚集IgG抑制ERFC恢復(fù)試驗以及單核、巨噬功能試驗,發(fā)現(xiàn)蟾酥制劑可增高小鼠脾臟抗體形成細胞活性率,激活小鼠腹腔游走巨噬細胞,提高其吞噬細菌和抑制細菌的能力[5],也能穩(wěn)定提高放射線照射治療后下降的白細胞數(shù)量[6];日本研究人員,從生藥蟾酥水溶性非透析部分中發(fā)現(xiàn)了促淋巴細胞增殖物質(zhì),該部分過Con A-瓊脂糖親和色譜柱后,作用明顯增強,經(jīng)分析得知,其有效成分之一為含 D-甘露糖、分子量約13 k Da的糖蛋白,純化后能提高脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-2和IL-12的水平,增強C3H/HeN小鼠脾淋巴細胞的天然殺傷力[7];蟾酥水溶性總成分能增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能,提高機體非特異性免疫作用[8-9];華蟾素制劑能顯著增加環(huán)磷酰胺(CTX)所致的免疫抑制狀態(tài)下的小鼠血清中的IgG含量,顯著增加CTX所致白細胞減少癥的小鼠外周血白細胞數(shù),提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù),表明華蟾素對細胞免疫,體液免疫和非特異性免疫均有促進作用;華蟾素注射液還可以誘導(dǎo)外周血單核細胞產(chǎn)生IL-2,增加LAK細胞的殺傷活性,可見華蟾素制劑的免疫增強作用也是其抗腫瘤作用機理之一[10]。

[1] 程相朝,張春杰,李銀聚,等.中藥免疫增強劑對肉仔雞免疫器官生長發(fā)育及免疫活性細胞影響的研究[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志,2002(3)：6-8.

[2] 汪莉,蘇軍,蘇寧.低聚糖對蛋雛雞生長性能、免疫器官發(fā)育及糞臭的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2001,11：9-11.

[3] 王福傳,韓一超,趙洪恩,等.復(fù)方中藥蟾酥免疫增強劑對雞免疫器官組織形態(tài)學(xué)影響的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2001,23(6)：419-421.

[4] 程相朝,陳樹興,郭曹彰,等.中藥蟾酥免疫增強劑對 MD雞外周血液ANAE T淋巴細胞動態(tài)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),1998,1：34-36.

[5] 謝麟,長青.蟾蜍產(chǎn)品的醫(yī)藥價值及其資源的開發(fā)利用[J].四川畜牧獸醫(yī),2002,29(12)：32-34.

[6] 王鋒,張薇,董紅兵.蟾酥的藥理研究及其臨床應(yīng)用概況[J].國醫(yī)論壇,2003,18(5)：50-52.

[7] 王學(xué)勇.蟾酥中含有免疫調(diào)節(jié)劑[J].國際中醫(yī)中藥雜志,2006,28(3)：150.

[8] 徐立然.蟾蜍的生物毒療作用[J].中國民間療法,2000,8(2)：23-24.

[9] 程國華.蟾酥質(zhì)量研究及其藥理臨床應(yīng)用進展[J].中草藥,2001,32(2)：184-186.

[10]韓鴻彬,陳嘉勇.華蟾素抗腫瘤作用及其機制的研究進展[J].中國腫瘤生物治療雜志,2005,12(2)：160-162.