光皮樹優(yōu)良無性系組織培養(yǎng)的無菌體系建立

本瑪麗， 王曉明,， 李永欣， 曾慧杰， 蔡 能

(1．中南林業(yè)科技大學, 湖南 長沙 410004 2.湖南省林業(yè)科學研究院, 湖南 長沙 410004;3.林木無性系育種湖南省重點實驗室, 湖南 長沙 410004)

光皮樹優(yōu)良無性系組織培養(yǎng)的無菌體系建立

本瑪麗1， 王曉明1,2,3， 李永欣2,3， 曾慧杰2,3， 蔡 能2,3

(1．中南林業(yè)科技大學, 湖南 長沙 410004 2.湖南省林業(yè)科學研究院, 湖南 長沙 410004;3.林木無性系育種湖南省重點實驗室, 湖南 長沙 410004)

以光皮樹優(yōu)良無性系的嫩枝莖段為試驗材料，研究不同時期的外植體、滅菌處理與植物激素對接種污染率和無菌外植體得率的影響。結果表明，秋季帶頂芽的嫩莖為接種培養(yǎng)的適宜外植體，外植體最佳消毒方法為75%酒精浸泡10s后，用2～3滴吐溫80的0.1%升汞溶液消毒7～9min。試驗獲得了光皮樹適宜的初代培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.05mg· L-1+PVP 300mg·L-1+蔗糖30g·L-1。

光皮樹； 組織培養(yǎng)； 污染率； 外植體

光皮樹(CornuswilsonianaWanaer)為山茱萸科梾木屬落葉灌木或喬木，集中分布于長江流域至西南各地的石灰?guī)r區(qū)，黃河及以南流域也有分布[1]。以其果實為原材料制取的生物柴油與0#柴油燃燒性能相似，是一種安全(閃點﹥105)、潔凈(灰分﹤0.003)的生物質(zhì)燃料油[2-3]。開展光皮樹種植，發(fā)展生物質(zhì)能源林，具較高的經(jīng)濟、生態(tài)與社會效益。湖南省林業(yè)科學院已選育出了湘林1～8號早實、高產(chǎn)光皮樹優(yōu)良無性系，并用光皮樹油為原料通過脂化工藝制取了生物柴油[4]。在深入研究了光皮樹生物學特性和生態(tài)習性的基礎上，研究出光皮樹嫁接繁殖技術，嫁接成活率高達90%，但嫁接繁殖育苗周期長，繁殖系數(shù)小，難以滿足生物能源林建設對光皮樹優(yōu)良無性系優(yōu)質(zhì)種苗的需求，因此，迫切需要開展光皮樹的組培快繁技術研究[5]。

目前對光皮樹的研究不是很多，王世國等[6]認為光皮樹是石灰?guī)r山地造林的良好樹種；成訓妍[7]、梁仰貞[8]認為光皮樹是珍貴的木本食用油料資源；李正茂等[3]提出光皮樹油將是一種理想的生物質(zhì)液體燃料；陳景震等[9]研究了光皮樹果實生長發(fā)育規(guī)律；刑義滿等[10]對光皮樹油酯化和動力性能進行了綜合研究。但至今未見有關光皮樹組織培養(yǎng)的研究報道。本文旨在建立光皮樹優(yōu)良無性系組織培養(yǎng)無菌體系，為規(guī)模化生產(chǎn)光皮樹無性系組培苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

本試驗以光皮樹優(yōu)良無性系為研究對象。外植體采集于湖南省長沙市天際嶺光皮樹示范基地5年生光皮樹優(yōu)良無性系G1，分別于春季、夏季和秋季，從當年抽生的新梢上剪取帶頂芽或腋芽、無病蟲害、無破損、生長旺盛的嫩枝莖段，去掉所有的葉片，當天將采集的嫩枝保濕帶回實驗室，取頂端4～6cm作為培養(yǎng)材料。

1.2外植體消毒

將采集回的嫩枝，剪去葉片，留葉柄基部，先置于燒杯中，放在自來水下，用流水沖洗約1.5h，用軟毛刷蘸洗潔精或洗衣粉溶液輕輕刷洗，自來水沖洗凈后，浸泡在洗衣粉溶液10min，用自來水沖洗3～5遍，再用0.1%的百菌清(75%可濕性粉劑，上海升聯(lián)化工有限公司)溶液中浸泡3min后，用自來水沖洗潔凈；將外植體置于超凈工作臺，用75%酒精浸泡10～20s，無菌水沖洗2～3次,再加含有2～3滴吐溫80的0.1%的升汞消毒7～9min，或在0.2%的次氯酸鈉溶液中浸泡15～25min，無菌水沖洗5～8次，用消毒濾紙吸干外植體表面水分[11]。

1.3接種

在無菌條件下接種。將消毒處理了的莖段，切成1.5～2.0cm長。腋芽的芽上莖節(jié)部分短一些，芽下莖節(jié)部分長一些，將原切口重新切出新的茬口。將消毒后的莖段接種在不同的初代培養(yǎng)基上。原始外植體經(jīng)接種培養(yǎng)后，當腋芽長至1.5～2.0cm長，剔除發(fā)霉和不萌芽的，選取已萌芽的無菌外植體進行繼代培養(yǎng)。

1.4培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，附加成分6-BA、NAA、PVP和活性炭。附加成分按不同的配比加入基本培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基含瓊脂0.8%，蔗糖3%，pH 5.8。培養(yǎng)基用300mL的廣口瓶分裝，每瓶30mL，封口膜包扎，在121℃和1.1 kg·cm-2條件下用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20min。培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照1500～2000lx，每日光照時間為12h。

2 試驗設計

2.1不同消毒滅菌處理試驗

設計6個消毒滅菌處理：75%酒精浸泡10s后，在0.1%升汞(加入2～3滴吐溫80)中浸泡7min、8min、9min或在0.2%的次氯酸鈉溶液中浸泡15min、20min、 25min(見表1)。每個處理分別接種100瓶，每瓶接種1 個外植體，每處理頂芽30個，腋芽70個。初代培養(yǎng)基為MS+BA 1.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1+PVP 300mg·L-1+蔗糖30g·L-1，以不加激素的培養(yǎng)基為對照。接種3d后，若發(fā)現(xiàn)細菌感染者，及時剔除，并記錄外植體的愈傷組織形成及其萌芽過程。接種30d后，調(diào)查外植體的污染率、無菌苗得率，統(tǒng)計外植體萌芽率。

表1 外植體的不同消毒滅菌處理處理編號A1A2A3A4A5A6處理02%的次氯酸鈉15min02%的次氯酸鈉20min02%的次氯酸鈉25min升汞7min升汞8min升汞9min

2.2不同時期的外植體試驗

設計4個不同時期的外植體，分別于4月15日、7月23日、9月16日，從當年抽生的新梢上剪取帶頂芽或腋芽的健壯嫩枝莖段，帶回實驗室進行試驗。消毒滅菌處理為： 75%酒精浸泡10s后，用0.1%升汞(加入2～3滴吐溫80)溶液消毒7～9min。每個處理分別接種100瓶，每瓶接種1個外植體，每處理頂芽30個，腋芽70個。初代培養(yǎng)基為MS+BA 1.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1+PVP 300mg·L-1+蔗糖30g·L-1，以不加激素的培養(yǎng)基為對照。接種3d后，若發(fā)現(xiàn)細菌感染者，及時剔除，并記錄外植體的愈傷組織形成及其萌芽過程。接種30d后，調(diào)查外植體的污染率、總成活率，統(tǒng)計誘導率。

2.3不同的抗褐變劑及其濃度抑制光皮樹組培苗褐變的試驗

PVP設計(100mg·L-1、200mg·L-1、300mg·L-1)3種濃度，活性炭設計(100mg· L-1、200mg· L-1、300mg·L-1)3種濃度，將抗褐變劑添加在MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1培養(yǎng)基中，以不加抗褐變劑的培養(yǎng)基為對照，供試材料為9月份的莖段，每個處理分別接種100瓶，每瓶接種1個外植體。接種30d后，調(diào)查外植體的褐變率。

2.4初代培養(yǎng)基適宜的激素配比試驗

以消毒滅菌效果最佳的處理(75%酒精浸泡10s后，加入2～3滴吐溫80的0.1%升汞溶液消毒7～9min)進行外植體消毒，切取莖段1.5～2.0cm長，接種到MS基本培養(yǎng)基中，附加蔗糖30g·L-1。試驗因子為6-BA(0.5，1.0，2.0mg· L-1)、NAA(0.05mg· L-1)的不同水平組合，隨機區(qū)組設計，共制備3種培養(yǎng)基。外植體為秋季帶腋芽的嫩枝莖段,每瓶接種1 個外植體，每處理接種100瓶。

3 結果與分析

3.1不同消毒處理對接種污染率及無菌外植體得率的影響

試驗結果(見表2)表明，不同的消毒處理，供試外植體的污染率和無菌外植體得率有差異。從表2還可以看出，不同的季節(jié)采樣，升汞消毒明顯好于0.2%次氯酸鈉溶液，延長升汞消毒時間可降低外植體的污染率，但無菌苗得率并沒有明顯增加。試驗結果也說明，升汞消毒時間對降低外植體污染率和提高無菌苗得率的影響不大，光皮樹滅菌適宜升汞處理時間為7～9min。

表2 不同消毒處理外植體的污染率和無菌外植體得率(%)處理號A1A2A3A4A5A6污染率897875554336無菌苗得率11011131515

3.2不同時期的外植體對接種污染率及無菌外植體得率的影響

試驗結果表明： 9月采取的材料，在接種后7～10d腋芽萌發(fā)，25～30d后腋芽萌發(fā)率和腋芽長度分別為78.3%和2.2cm，葉片淡綠色，腋芽生長較快。而于4月和7月采取的外植體，在接種后3～4d左右開始褐變，9～10d后褐變非常嚴重，外植體萎縮或變黑死亡，腋芽沒有或很少萌發(fā)。

在不同季節(jié)剪取外植體，經(jīng)酒精和次氯酸鈉或升汞消毒滅菌后接種在啟動培養(yǎng)基上，從其污染情況看，以秋季(9月)剪取的莖段，其無菌苗得率比較高，可達30%，而春季和夏季生長的嫩莖，無菌苗得率均較低，僅有15%(見表3)，這可能與材料本身有關，雖然春季和夏季嫩梢，營養(yǎng)充足，生長旺盛，但因光皮樹本身易褐變，太嫩的枝條更甚，不適合滅菌處理，而秋季莖段粗壯，木質(zhì)化程度相對較高，對滅菌劑的耐受力強，褐變輕，其無菌苗得率較高。

表3 外植體不同剪取時期對無菌苗得率影響的試驗結果(%)消毒處理嫩莖春季(4月/15日)夏季(7月/23日)秋季(9月/16日)升汞7min131327升汞8min151530升汞9min151428

秋季嫩枝用0.1%升汞消毒處理8min，外植體萌發(fā)也較快，接種于初代培養(yǎng)基后，非染菌芽7d左右就萌發(fā)，24d萌芽可長至1.0～1.5cm長；春季、夏季的外植體接種后約10d開始萌芽。試驗結果也表明，春、夏、秋三個季節(jié)的嫩枝，頂芽萌發(fā)比腋芽平均早1～3d左右，接種25d，頂芽萌發(fā)的新芽生長量比腋芽的平均高0.5cm。

由此可以確定，光皮樹組培快繁初代培養(yǎng)的外植體及其消毒滅菌處理方式，以秋季帶頂芽的嫩莖為接種培養(yǎng)的最佳材料，消毒滅菌處理則以75%酒精浸泡10s后，在0.1%升汞中浸泡7～9min為最佳。這與一般植物[7]初代培養(yǎng)時采樣時間不一致，可能與光皮樹自身的基因型和生理生化狀況有關。

3.3不同抗褐變劑及其濃度抑制光皮樹組培苗褐變的效果

由表4可以看出，PVP的抗褐變效果明顯好于活性炭，添加300mg· L-1PVP的培養(yǎng)基中，組培苗褐變率僅為28%，而添加活性炭300mg· L-1的培養(yǎng)基中，組培苗褐變率高達62%；不加抗褐變物質(zhì)則所有的試驗材料均褐變，說明抗褐變劑在光皮樹組織培養(yǎng)過程中非常重要。

表4 不同抗褐變劑及其濃度抑制光皮樹組培苗褐變試驗結果抗褐變劑處理(mg·L-1)褐變率(%)PVP10036PVP20033PVP30028活性炭10083活性炭20069活性炭30062對照(CK)100

3.4初代培養(yǎng)基的激素配比對誘導外植體萌芽的影響

從表5可看出，光皮樹外植體接種在4種培養(yǎng)基中，都可不同程度萌發(fā)出新芽。一般接種后4～5d，莖段基部膨大，7～9d后由葉腋處或頂芽陸續(xù)長出新芽，30d后可伸長到1.1～1.6cm。在4號培養(yǎng)基 (MS+6-BA 2.0mg· L-1+NAA 0.05mg· L-1+PVP 300mg· L-1) 上每個外植體平均萌發(fā)芽數(shù)最多，為1.69，其萌發(fā)新芽的生長情況較好；而在1號培養(yǎng)基(MS+6-NAA 0.05mg· L-1)上每個外植體平均萌發(fā)芽數(shù)最少，僅為0.82。這說明光皮樹初代培養(yǎng)基中不宜單獨附加NAA，應添加一定濃度6-BA，且適當提高6-BA濃度可促進外植體萌芽。

表5 初代培養(yǎng)基的不同激素配比試驗結果處理附加成分6—BANAA外植體平均萌芽數(shù)(個)苗均高(cm)100005082110205005138143310005153135420005169128

4 結論

在光皮樹無性系組織培養(yǎng)無菌體系建立的試驗中，不同的消毒處理、不同時期及不同類型的外植體對其污染率和無菌外植體得率存在差異。研究結果表明，初代培養(yǎng)的外植體以秋季帶頂芽的嫩莖為接種培養(yǎng)的最佳外植體，適宜的外植體消毒滅菌處理方法為：75%酒精浸泡10s后，用含2～3滴吐溫80的0.1%升汞溶液消毒7～9min。

初代培養(yǎng)基的激素配比對誘導外植體萌芽及其生長有影響。光皮樹優(yōu)良無性系適宜初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg·L-1+ NAA 0.05mg· L-1+PVP 300mg· L-1+蔗糖30g·L-1。

[1] 謝紅梅，李華.光皮樹播種育苗技術[J].農(nóng)村實用技術,2008，6：44.

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[3] 李正茂,鄧新華,李黨訓.光皮樹經(jīng)濟性狀及生物質(zhì)液體燃料開發(fā)研究構想[J].湖南林業(yè)科技，1996,23(2):11-13.

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[10] 刑義滿,蔣崇林.光皮樹油酯化制取生物柴油的中試研究[J].新能源，1997，19(4)：38-40.

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(責任編輯：譚著明)

GermfreesystemestablishmentoftissueculturefromthesuperiorcloneofCornuswilsoniana

BEN Mali1, WANG Xiaoming1,2,3, LI Yongxin2,3, ZENG Huijie2,3, CAI Neng2,3

(1.Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 2.Hunan Forestry Academy,Changsha 410004, China; 3.Hunan Key Laboratory of Trees Clones Breeding Technology, Changsha 410004, China)

Taken young stem segments of the superior clone ofCornuswilsonianaas experimental materials, the effects of different explants, sterilization treatment and phytohormone on pollution rate and germfree explants rate were researched. The results showed that the suitable explants were the segments of young stem with terminal bud in autumn. And the optimum explants sterilization method was to dip in 75% alcohol for 10s, then in 0.1% HgCl2with 2～3 drops tween-80 for 7～9min. The suitable medium for primary culture ofCornuswilsonianawas MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1+PVP 300mg·L-1+sucrose 30g·L-1.

Cornuswilsoniana; tissue culture; pollution rate; explants

2010-02-24

2010-03-15

國家“十一五”科技支撐計劃《林木優(yōu)質(zhì)種苗快繁技術研究與示范推廣》(2008BADB7B03)

本瑪麗(1984-)，女，湖南省郴州市人，碩士研究生，從事經(jīng)濟林育種與栽培研究。

S 722.3+7

A

1003-5710(2010)02-0005-03