毒死蜱對植物膽堿酯酶活性的抑制作用研究

李遠平,陳華才,朱旭華

(中國計量學院生命科學學院,浙江杭州310018)

有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是目前我國廣泛使用的主體殺蟲劑,由于其脂溶特點,多數(shù)情況下性狀穩(wěn)定而不易分解,對環(huán)境的污染、農(nóng)作物中殘留及生態(tài)產(chǎn)生的影響不容忽視[1].酶抑制法作為農(nóng)藥殘留快速檢測方法,因其操作簡便快速且無須昂貴儀器,因而在農(nóng)貿(mào)市場、超市等現(xiàn)場檢測中得到廣泛應(yīng)用[2].動物膽堿酯酶和有機磷水解酶作為酶抑制法的兩種酶源都不太適合現(xiàn)場快速檢測[3],相對于動物膽堿酯酶和有機磷水解酶而言,植物酯酶具有酶源豐富、取材方便、成本較低、制備簡單、保質(zhì)期長等優(yōu)點,因此篩選活性高、敏感性好、高效價廉的植物酯酶,優(yōu)化檢測條件,建立快速檢測方法具有重要社會及經(jīng)濟價值.林素英等[4]研究多種豆類酯酶表明以綠豆酯酶的總酯酶活力和敏感性為最好,本文以綠豆酯酶為研究對象,優(yōu)化了其反應(yīng)條件以及被毒死蜱抑制的檢測條件,為綠豆酯酶應(yīng)用于蔬菜中毒死蜱殘留的快速檢測奠定基礎(chǔ).

1 儀器與材料

1.1 材 料

綠豆購自杭州下沙物美超市.

1.2 試 劑

冰乙酸 、丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、α-乙酸萘酯、固藍B鹽均為分析純;有機磷農(nóng)藥毒死蜱標樣(Sigma公司).

1.3 儀 器

T U-1901型紫外可見分光光度計(普析通用儀器有限公司),冷凍離心機,恒溫水浴鍋,恒溫振蕩器,電子天平.

2 試驗方法

2.1 基本原理

膽堿酯酶催化α-乙酸萘酯水解為 α-萘酚和乙酸,α-萘酚與顯色劑固B鹽作用形成紫紅色的偶氮化合物,測定該物質(zhì)的吸光度值即可表示酶活性大小.有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶具有抑制作用,如果試樣中沒有農(nóng)藥殘留或者殘留量極小,酶的活性不被抑制,α-乙酸萘酯被催化水解,水解產(chǎn)物通過與顯色劑作用顯色;反之,如果農(nóng)藥殘留量較高,酶的活性就會被農(nóng)藥所抑制,水解產(chǎn)物減少或者沒有產(chǎn)物生成[5].通過吸光值的變化可表示酶被抑制的程度,進而反映有機磷農(nóng)藥的含量.

2.2 試劑配制

磷酸緩沖液:

A:0.2 mol/L Na2HPO4,準確稱取 71.64 g該試劑用蒸餾水定容至1 000 mL

B:0.2 mol/L NaH2PO4,準確稱取31.20 g該試劑用蒸餾水定容至1 000 mL

然后根據(jù)A,B液的不同比例配置不同pH的磷酸緩沖液.

α-乙酸萘酯溶液 :將125 mg α-乙酸萘酯溶于100 mL無水乙醇.

顯色劑:將50 mg固藍B鹽溶于100 mL蒸餾水中.

終止液:30mL冰乙酸加蒸餾水定容至100mL.

有機磷農(nóng)藥標樣的制備:取毒死蜱標樣儲備液(25 mg/mL),準確吸取0.1 mL標準物質(zhì),用丙酮稀釋并定容至100 mL,質(zhì)量濃度為25 μ g/mL作為母液.吸取適量的母液,用pH 6.7的緩沖液稀釋并定容至100 mL,使農(nóng)藥最終質(zhì)量濃度分別為0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,1.5,2.0 μ g/mL,4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

2.3 粗酶液制備及粗酶含量測定

發(fā)芽24 h的綠豆冰浴研磨后,按1∶5(w/v)加入pH 6.5的0.2 mol/L磷酸緩沖液,40℃,120 r/min條件下振搖2 h,取出迅速過濾,清液以4500 r/min,4℃離心10 min,上清液為粗酶液[6].以牛血清蛋白作標準,用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量[7].

2.4 酯酶催化α-乙酸萘酯水解條件優(yōu)化

2.4.1 最大吸收波長的確定 取1 mL粗酶液加3 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.7)和0.1 mL α-乙酸萘酯溶液,40℃反應(yīng)10 min后加0.6 mL顯色劑,顯色10 min后加入2 mL終止液并定容至20 mL,室溫下400～700 nm范圍內(nèi)掃描其吸光度值,確定最大吸收波長.

2.4.2 粗酶液濃度對水解反應(yīng)的影響 在上述反應(yīng)體系中,粗酶液添加量分別為0.05,0.1,0.15,0.2,0.3 mL,考察粗酶液濃度對水解反應(yīng)的影響.

2.4.3 顯色時間與吸光度的關(guān)系 在上述反應(yīng)體系中,分別測定顯色1,5,10,15,20 min后的吸光度值.

2.4.4 溫度對酶促反應(yīng)的影響 上述反應(yīng)體系分別在30℃,35℃,40℃,45℃,50℃恒溫水浴下反應(yīng)10 min,顯色10 min后最大吸收波長下測定吸光度值,確定最佳酶促反應(yīng)溫度.

2.4.5 pH對酶促反應(yīng)的影響 上述反應(yīng)體系中,緩沖液pH值分別為5.9,6.3,6.7,6.9,7.1,7.5,水解、顯色后測定吸光度值,確定反應(yīng)體系的最佳pH值.

2.4.6 酶促反應(yīng)時間的確定 上述反應(yīng)體系中,酶促水解反應(yīng)時間分別為5,10,15,20 min,顯色后測定吸光值,確定最佳酶促反應(yīng)時間.

2.4.7 農(nóng)藥抑制時間的確定 上述反應(yīng)體系中,加入1 μ g/mL的毒死蜱農(nóng)藥標樣,抑制時間分別為2,4,6,8 min,顯色后最大吸收波長處測定吸光度值,確定農(nóng)藥最佳抑制時間.

2.5 農(nóng)藥濃度與抑制率標準曲線的繪制

取7支試管,分別加入3 mL pH 6.7磷酸鹽緩沖溶液,1 mL的植物酯酶溶液,1 mL有機磷標準溶液(分別為 0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,1.5,2.0 g/mL),40℃下反應(yīng)2 min后,加入0.1 mL的α-乙酸萘酯溶液,40℃下酶解反應(yīng)5 min,再加入0.6 mL固藍B鹽溶液,40℃下顯色反應(yīng)10 min后加入2 mL乙酸終止液,定容至20 mL后在520 nm處測得吸光度A,以不加有機磷農(nóng)藥和α-乙酸萘酯溶液為參比.以不加有機磷農(nóng)藥為空白,同上的操作測得A0,按下式計算抑制率:

2.6 靈敏度及檢測限的測定

參照薛曉榮方法[8]:取15支試管,分別加入3 mL pH 6.7磷酸鹽緩沖溶液,1 mL的植物酯酶溶液,加入0.1 mL的蒸餾水,40℃下恒溫水浴5 min,再加入0.6 mL固藍B鹽溶液,40℃下顯色反應(yīng)10 min后加入2 mL終止液,定容至20 mL后在520 nm處測得吸光度A0.

3 結(jié)果與分析

3.1 粗酶提取及蛋白質(zhì)含量測定

綠豆發(fā)芽24 h后,去皮,冰浴研磨,0.2 mol/L磷酸緩沖液提取,過濾離心后獲得綠豆酯酶粗酶液,粗酶液澄清透明.考馬斯亮藍法測定粗酶液的蛋白質(zhì)含量為3.44 mg/mL.

3.2 酯酶水解產(chǎn)物吸收曲線

發(fā)芽綠豆提取的酯酶液催化α-乙酸萘酯水解,水解產(chǎn)物與固藍B顯色呈紫紅色,在400～700 nm范圍內(nèi)的吸收光譜曲線如圖1所示,在520 nm處有最大吸收值,無背景干擾,可作為定量分析測量波長.后面的實驗都以此最大吸收波長點的吸光度值比較.

圖1 顯色后反應(yīng)體系的吸收光譜Figure 1 Absorption spectrum of color reaction system

3.3 粗酶液添加量與吸光度的關(guān)系

粗酶液添加量與水解產(chǎn)物吸光度值的關(guān)系如圖2,吸光度值隨著粗酶液的添加量增加而升高,考慮到測量誤差和經(jīng)濟性,粗酶液添加量以0.15～0.3 mL(0.52～1.04 mg)較適宜.

圖2 酶液添加量與吸光度的關(guān)系Figure 2 Relationship between the enzyme concentration and the absorbance

3.4 顯色時間對吸光度的影響

酯酶催化α-乙酸萘酯水解,產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng),生成紫紅色偶氮化合物.吸光度與顯色時間的關(guān)系如圖3,顯色10min時吸光度最大,達到了0.61,并在隨后的5 min之內(nèi)保持相對穩(wěn)定,15 min后吸光度急劇下降.因此,樣品應(yīng)在添加顯色劑10 min后開始測量吸光度值,并在5 min內(nèi)測量完畢.

3.5 反應(yīng)溫度對吸光度的影響

反應(yīng)體系溫度與吸光度關(guān)系如圖4.40℃時,酶活性最強,吸光值最大,以此作為酶促反應(yīng)和顯色溫度.

3.6 pH對酶促反應(yīng)的影響

緩沖溶液的pH值不僅影響酯酶的活性,也影響水解產(chǎn)物與顯色劑的顯色反應(yīng).圖5為緩沖溶液pH值與吸光度的關(guān)系,pH 6.7時有最大吸光度值.

圖5 pH值與吸光度關(guān)系Figure 5 Relationship between the pH and the absorbance

3.7 酶促水解反應(yīng)時間的確定

圖6為酯酶催化α-乙酸萘酯水解反應(yīng)時間與吸光度的關(guān)系.由圖中可知當酶促反應(yīng)時間在5 min時吸光值已達到最大值,隨著反應(yīng)時間的延長吸光值保持穩(wěn)定,因此本反應(yīng)體系選擇以5 min作為酶促反應(yīng)時間.

圖6 酶促反應(yīng)時間與吸光度關(guān)系Figure 6 Relationship between the reaction time and the absorbance

3.8 農(nóng)藥對酯酶抑制時間的確定

圖7為農(nóng)藥抑制時間與酶活性抑制率的關(guān)系.農(nóng)藥對酯酶的抑制率在2～4 min之內(nèi)較高,并基本保持穩(wěn)定.因此,農(nóng)藥對酯酶的抑制時間應(yīng)控制在2～4 min之內(nèi).

圖7 農(nóng)藥抑制時間與抑制率的關(guān)系Figure 7 Relationship between the time and the enzyme inhibition rate

3.9 毒死蜱對酶的抑制標準曲線

毒死蜱對酯酶活性的抑制率與濃度成線性關(guān)系,抑制曲線如圖8,毒死蜱的質(zhì)量濃度在0～2.5 μ g/mL間,線性關(guān)系較好,相關(guān)系數(shù)為0.983 9.因此,在此線性范圍內(nèi),可以通過酯酶活性抑制率計算出溶液有機磷農(nóng)藥毒死蜱的殘留量,并據(jù)此建立毒死蜱等有機磷農(nóng)藥快速檢測方法.

圖8 毒死蜱對酶的抑制曲線Figure 8 Inhibition curve of chlorpyrifos to the enzyme

表1 空白試驗結(jié)果Table 1 Blank experiment results

3.10 靈敏度和檢測限

通過實驗我們測得了15個空白樣本的吸光度,如表1.靈敏度計算得:

檢測限計算得:

4 討 論

本試驗確定了從發(fā)芽綠豆中提取的膽堿酯酶液與α-乙酸萘酯進行酶促反應(yīng)過程中的最大吸收波長為520 nm,粗酶液添加量為0.52 mg,反應(yīng)時間5 min,顯色時間10 min,反應(yīng)溫度 40℃,反應(yīng)pH為6.7;農(nóng)藥對酯酶的抑制時間為2 min,毒死蜱對綠豆酯酶活性的標準抑制曲線相關(guān)系數(shù)達到0.983 9,檢測靈敏度和檢測限分別為0.006 7 μ g/mL和0.08 μ g/mL,應(yīng)用該植物酯酶檢測毒死蜱基本能夠滿足國家標準對毒死蜱殘留限量測定的要求.

研究表明,酶促反應(yīng)體系的溫度以及pH值對結(jié)果的影響較大,因此,在整個試驗中反應(yīng)溫度應(yīng)保持在40℃左右,pH值應(yīng)保持在6.7左右.

固藍B鹽顯色液非常不穩(wěn)定,研究表明在室溫下40 min后固藍B鹽顯色液顯色能力大大下降[6],同時在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)固藍B鹽顯色劑溶液若放置時間過長溶液顏色加深影響實驗結(jié)果,因此顯色液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用.顯色反應(yīng)在10～15 min之間會有一個平臺期,吸光度基本變化不大有利于實驗數(shù)據(jù)的測量,因此我們選擇顯色10 min作為顯色時間,并以終止液終止顯色反應(yīng)后測量吸光度.與乙酰膽堿酯酶法相比,本方法在顯色后使用終止液有效地提高了測量的準確性.

由于酶是一種生物活性物質(zhì),在液體狀態(tài)下保存極易導致酶失活或引起酶的變性.有研究表明粗酶液在冷藏條件下可以保存1周[9],提取的綠豆酯酶在4℃冰箱中可保存1～2周時間.近年來研究人員利用酶固定化技術(shù)解決酶液難以貯藏的問題,許學勤等[10]用離子交換樹酯作為固定化載體對小麥酯酶進行了固定化后穩(wěn)定性有很大的提高.因此下一步的實驗工作需對該植物膽堿酯酶的提純、濃縮條件,酶的穩(wěn)定性及保存方法作進一步的研究和探討.

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