五味子萃取物對去卵巢小鼠行為習(xí)得及海馬AChE活性的影響

謝 珣， 楊美燕， 吳伯智， 姚麗華， 李楚華

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631)

五味子萃取物對去卵巢小鼠行為習(xí)得及海馬AChE活性的影響

謝 珣， 楊美燕， 吳伯智， 姚麗華， 李楚華*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631)

探討五味子改善去卵巢小鼠學(xué)習(xí)能力的有效化學(xué)部位及相關(guān)的作用途徑.采用溶劑極性遞增法萃取分離五味子的醇提物，小鼠卵巢摘除6周后灌胃同等劑量的五味子萃取物，三等分輻射式迷宮檢測小鼠的行為習(xí)得能力，并測定小鼠海馬乙酰膽堿酯酶的活性.結(jié)果顯示，去卵巢使小鼠每日的正確反應(yīng)率和達(dá)標(biāo)率明顯降低(P<0.05,P<0.01)，且海馬中AChE的活性降低(P<0.05)；苯甲酸雌二醇、五味子正丁醇萃取物及乙醇萃取物均能明顯提高去卵巢小鼠的正確反應(yīng)率和達(dá)標(biāo)率(P<0.05,P<0.01)，而苯甲酸雌二醇和五味子正丁醇萃取物顯著提高去卵巢小鼠海馬AChE的活性(P<0.05,P<0.01)，提示五味子正丁醇萃取物及乙醇萃取物均能顯著提高去卵巢小鼠的學(xué)習(xí)能力，其中五味子正丁醇萃取物的功效優(yōu)于乙醇萃取物，可能是五味子改善學(xué)習(xí)記憶的主要有效部位，其作用的途徑可能與膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān).

五味子萃取物； 去卵巢小鼠； 行為習(xí)得； 乙酰膽堿酯酶

阿爾茨海默癥(Alzheimer Disease, AD)是以進(jìn)行性記憶和智能減退為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變疾病.臨床研究表明，在婦女絕經(jīng)過渡期和絕經(jīng)后期，記憶衰退是非常普遍的現(xiàn)象[1].雌激素替代療法(Estrogen replacement Therapy, ERT)可以改善絕經(jīng)婦女的記憶功能和減低發(fā)生AD病的風(fēng)險(xiǎn)或推遲患病年齡，但同時(shí)又可能帶來一些副作用，如可增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、卵巢癌等的發(fā)病率[2-3].因此，尋找天然的類雌激素藥物成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn).

中藥五味子具有益智安神、延緩衰老等作用.我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)五味子對D-半乳糖所致的癡呆動物模型具有明顯的記憶改善作用[4]；五味子的醇提物顯著提高正常小鼠的學(xué)習(xí)能力[5]，改善去卵巢小鼠的記憶保持[6].本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，以去卵巢小鼠為動物模型，采用溶劑極性遞增法進(jìn)一步萃取分離五味子的醇提物，觀察不同極性萃取物對去卵巢小鼠學(xué)習(xí)能力的影響，并測定小鼠海馬乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)的活性，探討五味子改善去卵巢小鼠學(xué)習(xí)能力的有效化學(xué)部位及相關(guān)的作用途徑，為治療學(xué)習(xí)記憶障礙乃至老年癡呆提供新的用藥依據(jù).

1 材料和方法

1.1藥物制備及試劑

干燥的五味子果實(shí)5 kg，粉碎成粒徑約0.5 mm的小顆粒，等體積的石油醚浸漬24 h脫脂，回收濾液.殘?jiān)缘润w積的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇室溫浸泡24 h，共5次，合并提取液，過濾，減壓濃縮，得五味子醇提物.醇提物加2倍體積蒸餾水溶解，過濾后分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次進(jìn)行萃取，每種溶劑均萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮依次得五味子氯仿萃取物50 g，乙酸乙酯萃取物100 g，正丁醇萃取物124.08 g，五味子乙醇萃取物306.96 g，冷藏備用.用前分別將生藥用蒸餾水配成1 g/mL的水溶液.

主要試劑：苯甲酸雌二醇(上海第九制藥廠)、乙酰膽堿酯酶測試盒(南京建成生物工程研究所).

1.2動物模型建立及藥物處理

健康雌性昆明種小鼠，體質(zhì)量20±2 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2008-0020.動物隨機(jī)分為8組(n=9)：Ⅰ正常對照組(normal control)；Ⅱ假手術(shù)對照組(Sham operated control)；Ⅲ去卵巢模型對照組(Ovariectomized control)；Ⅳ陽性對照組(Positive control)；Ⅴ氯仿萃取物組(CHCl3extract group)；Ⅵ乙酸乙酯萃取物組(EAc extract)；Ⅶ正丁醇萃取物組(N-butanol extract)；Ⅷ乙醇萃取物組(Alc extract).

實(shí)驗(yàn)前，Ⅲ至Ⅷ組小鼠實(shí)施雙側(cè)卵巢摘除手術(shù).假手術(shù)組僅摘除卵巢周圍相當(dāng)于卵巢質(zhì)量的脂肪.術(shù)后2周對去卵巢小鼠行陰道涂片，認(rèn)為連續(xù)7 d陰道細(xì)胞無周期性變化者造模成功，可進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)[6].根據(jù)分組情況，手術(shù)6周后Ⅴ至Ⅷ組灌胃相應(yīng)藥物，劑量為0.4 mL/d(相當(dāng)于原生藥劑量0.4 g/d，分上、下午進(jìn)行)，Ⅰ至Ⅲ組灌胃相等體積的蒸餾水，Ⅳ組小鼠每次每只皮下注射20 μg苯甲酸雌二醇，隔天皮下注射1次.給藥20 d后開始進(jìn)行行為訓(xùn)練.

1.3行為訓(xùn)練

采用三等分輻射式迷宮(MG-2型迷宮刺激器)作為小鼠行為習(xí)得的檢測模型.刺激強(qiáng)度為30～50 V，每實(shí)驗(yàn)日訓(xùn)練20次，每次間隔20～40 s，正確反應(yīng)率≥90%即達(dá)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)訓(xùn)練8 d，記錄每實(shí)驗(yàn)日各組小鼠的正確反應(yīng)率、達(dá)標(biāo)小鼠的比率及達(dá)標(biāo)所需的訓(xùn)練次數(shù).

1.4海馬AChE活性的測定

行為訓(xùn)練結(jié)束后，小鼠禁食12 h，斷頭取腦，分離海馬，稱質(zhì)量，冷生理鹽水沖洗，按1∶9比例加入預(yù)冷的PBS，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%腦勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液測AChE的活性，按測試盒說明書操作.

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1去卵巢小鼠陰道上皮脫落細(xì)胞檢查

正常雌性小鼠陰道脫落細(xì)胞隨動情周期變化而變化：①動情前期：為有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化細(xì)胞；②動情期：為無核角化細(xì)胞或間有少量上皮細(xì)胞；③動情后期：各種細(xì)胞均有，即白細(xì)胞、角化細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞；④動情間期：為大量白細(xì)胞，極少量上皮細(xì)胞.觀察結(jié)果如圖1所示，去卵巢小鼠陰道脫落細(xì)胞只見大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞，細(xì)胞無周期性變化，角化程度極低，處于持續(xù)的動情間期.實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，小鼠雙側(cè)卵巢切除后其體內(nèi)雌激素水平持續(xù)低下.

圖1 小鼠陰道上皮脫落細(xì)胞涂片F(xiàn)ig.1 The epidermis cell in vagina of mice

2.2五味子不同極性萃取物對去卵巢小鼠行為習(xí)性的影響

2.1.1 五味子不同極性萃取物對去卵巢小鼠正確反應(yīng)率的影響 由表1可見，①假手術(shù)對照組與正常對照組小鼠每日的正確反應(yīng)率均相近，組間無顯著性差異(P>0.05)；②從行為訓(xùn)練第2 d開始，模型對照組小鼠每日的正確反應(yīng)率均低于正常對照小鼠(P<0.05,P<0.01)，訓(xùn)練8 d仍未能達(dá)標(biāo).陽性對照組小鼠從訓(xùn)練第3 d開始每日的正確反應(yīng)率均明顯高于去卵巢對照組(P<0.05,P<0.01)；③與模型對照組比較，氯仿組和乙酸乙酯組小鼠每實(shí)驗(yàn)日的正確反應(yīng)率均不存在顯著的差異(P>0.05)；④從行為訓(xùn)練第4 d開始，正丁醇組小鼠每日的正確反應(yīng)率均明顯高于模型對照組(P<0.01，P<0.05)；而乙醇組小鼠直到行為訓(xùn)練最后1 d其正確反應(yīng)率才明顯高于模型對照組(P<0.05)，其余時(shí)間2組間不存在顯著性差異.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：去卵巢使小鼠每日的正確反應(yīng)率明顯降低，而苯甲酸雌二醇、五味子正丁醇和乙醇萃取物卻能顯著提高去卵巢小鼠的正確反應(yīng)率，正丁醇萃取物的功效優(yōu)于乙醇萃取物.

表1 五味子不同極性萃取物對去卵巢小鼠正確反應(yīng)率的影響(n=9) %

注：1)P<0.05，2)P<0.01，與正常對照組比較；3)P<0.05，4)P<0.01，與去卵巢對照組比較.

2.2.2 五味子不同極性萃取物對去卵巢小鼠行為訓(xùn)練達(dá)標(biāo)率的影響 由表2可見，①假手術(shù)組與正常對照組每日小鼠達(dá)標(biāo)比率不存在明顯的差異.而模型對照組小鼠每天的達(dá)標(biāo)率均低于正常對照組小鼠，經(jīng)8 d的行為訓(xùn)練，只有66.7%的小鼠達(dá)標(biāo)，而正常對照組卻100%達(dá)標(biāo)，存在顯著性差異(P<0.05)；②氯仿組和乙酸乙酯組小鼠經(jīng)8 d行為訓(xùn)練，達(dá)標(biāo)率為55.6%，與模型對照組比較，不存在顯著性差異(P>0.05)；③陽性對照組小鼠在訓(xùn)練最后2 d達(dá)標(biāo)率均高于模型對照組(P<0.05).而正丁醇組小鼠從訓(xùn)練第4 d開始每日達(dá)標(biāo)率均高于模型對照組(P<0.05, 0.01).然而乙醇組小鼠直到訓(xùn)練最后1 d達(dá)標(biāo)率才高于模型對照組(P<0.05).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明五味子正丁醇和乙醇萃取物均能提高去卵巢小鼠行為訓(xùn)練的達(dá)標(biāo)率，五味子正丁醇萃取物效果明顯優(yōu)于乙醇萃取物，可能是五味子改善去卵巢小鼠學(xué)習(xí)的主要有效部位.

表2 五味子不同極性萃取物對去卵巢小鼠訓(xùn)練達(dá)標(biāo)率的影響(n=9) %

注：1)P<0.05，與正常對照組比較；2)P<0.05，3)P<0.01，與去卵巢模型對照組比較.

2.2.3 五味子不同極性萃取物對去卵巢小鼠達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)的影響 對訓(xùn)練8 d內(nèi)達(dá)標(biāo)小鼠所需訓(xùn)練次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì).結(jié)果如表3顯示，①模型對照組達(dá)標(biāo)小鼠所需訓(xùn)練次數(shù)與正常對照組沒有明顯差異，但直至訓(xùn)練結(jié)束仍有部分小鼠未達(dá)標(biāo)，而正常小鼠卻100%達(dá)標(biāo)；②各給藥組達(dá)標(biāo)小鼠所需訓(xùn)練次數(shù)與模型對照組比較均無顯著差異，但五味子氯仿、乙酸乙酯萃取物組則只有部分小鼠達(dá)標(biāo)，陽性對照組及五味子正丁醇、乙醇萃取物組小鼠則100%達(dá)標(biāo).

表3五味子不同極性萃取物對去卵巢小鼠達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)的影響

Tab.3 The effects of different extracts of Schisandra on the number of trainings

GroupsnnumberoftrainingsNormalcontrol978.90±37.90Shamoperatedcontrol980.00±26.40Ovariectomizedcontrol690.00±33.57Positivecontrol984.40±24.00CHCl3extract5116.67±19.66EAcextract564.00±29.66N-butanolextract972.70±28.60Alcextract981.30±35.80

注：n為達(dá)標(biāo)小鼠數(shù)量.

2.3五味子萃取物對去卵巢小鼠海馬AChE活性的影響

由上述行為學(xué)結(jié)果可知，在五味子乙醇提取物的各萃取物中，正丁醇萃取物及乙醇萃取物的功效較為顯著，因此在測定海馬AChE活性時(shí)，選取了上述2組.實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2可見，模型對照組小鼠海馬AChE活性較正常對照組明顯降低(P<0.05)；補(bǔ)充雌激素可顯著提高海馬AChE的活性(P<0.05)；而正丁醇萃取物組小鼠海馬AChE活性比模型對照組明顯升高，2組有極顯著差異(P<0.01)；但乙醇萃取物組小鼠海馬AChE活性與模型對照組比較，沒有明顯變化(P>0.05).結(jié)果表明去卵巢造成小鼠海馬AChE活性降低，而雌激素和五味子正丁醇萃取物能夠顯著提高其海馬AChE的活性.

圖2 五味子萃取物對去卵巢小鼠海馬AChE活性的影響

Fig.2 The effects of extracts of Schisandra on the activity of AChE in OVX mice

3 討論

本實(shí)驗(yàn)是在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步萃取分離五味子醇提物，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及預(yù)實(shí)驗(yàn)而確定本實(shí)驗(yàn)五味子各成分的給藥濃度[6].本實(shí)驗(yàn)研究表明，五味子4種萃取物中，氯仿和乙酸乙酯萃取物對去卵巢小鼠的學(xué)習(xí)能力無明顯改善作用；而正丁醇和乙醇萃取物則能有效改善去卵巢小鼠的學(xué)習(xí)能力，其中五味子正丁醇萃取物效果較乙醇萃取物顯著.由于正丁醇萃取物是從乙醇提取物中分離出來的一部分，推測其可能集中濃縮了五味子的有效成分，因此其功效優(yōu)于乙醇萃取物.

雌激素對人類及動物學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能具有重要的作用[7].實(shí)驗(yàn)報(bào)道在主動回避或水迷宮學(xué)習(xí)任務(wù)中，去卵巢大鼠明顯表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力的下降[8].在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到，去卵巢6周后，小鼠的學(xué)習(xí)能力明顯下降，而給予雌激素治療能夠改善去卵巢小鼠的學(xué)習(xí)能力.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雌激素的缺失引起認(rèn)知能力的下降.而五味子正丁醇萃取物卻能提高去卵巢小鼠的學(xué)習(xí)能力，其效果與雌激素接近，提示五味子正丁醇萃取物可能具有類雌激素作用.

中樞膽堿能神經(jīng)元在學(xué)習(xí)和記憶中有重要的調(diào)節(jié)作用.有研究證實(shí), 在AD患者的大腦皮質(zhì)、海馬、基底前腦存在廣泛的膽堿能神經(jīng)元的喪失[9].與此相一致的是，AD腦內(nèi)AChE的活力明顯下降, 尤以皮質(zhì)和海馬顯著，因此認(rèn)為AChE 活性的降低是膽堿能神經(jīng)元受損的標(biāo)志[10].但目前動物實(shí)驗(yàn)關(guān)于AD癥及用藥后海馬中AChE的活性變化仍存在爭議.這可能與模擬AD癥時(shí)程、用藥有效劑量等因素不同相關(guān).亦有認(rèn)為在AD疾病中，AChE的總活性呈降低趨勢，但在腦內(nèi)老年斑中是升高的，并且和Aβ有直接的相互作用[11].可見腦內(nèi)AChE的分布存在不均衡性，且與Aβ有密切關(guān)系.

海馬是與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的的重要腦區(qū)，而雌激素和海馬膽堿能系統(tǒng)之間存在復(fù)雜的聯(lián)系.有實(shí)驗(yàn)指出，去卵巢會減低海馬中高親和性膽堿的攝取和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的活性，而給予雌激素治療后，能顯著提高高親和性膽堿的攝取和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的活性[12].此外，絕經(jīng)后女性進(jìn)行雌激素治療能夠提高皮質(zhì)膽堿神經(jīng)末梢的密度[13].目前，在動物身上已發(fā)現(xiàn)海馬的CA3及CA1區(qū)的神經(jīng)元存在雌激素受體[14].實(shí)驗(yàn)表明，雌激素能通過與海馬中的受體相結(jié)合而影響海馬膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能.雌激素受體(ERa 和 ERβ)共存于海馬中，雌激素對海馬功能的調(diào)節(jié)可以通過基因機(jī)制，也可以通過快速的非基因機(jī)制[15].

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：去卵巢使小鼠海馬AChE的活性明顯降低，這與DAS[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.本實(shí)驗(yàn)還觀察到，在給予雌激素或五味子正丁醇萃取物治療后，去卵巢小鼠海馬中AChE活性顯著提高.而五味子乙醇萃取物雖對去卵巢小鼠的行為習(xí)得有一定促進(jìn)作用，但對AChE的活性并未產(chǎn)生明顯的影響.這進(jìn)一步表明了五味子改善去卵巢小鼠學(xué)習(xí)能力的主要有效成分集中于正丁醇萃取物中，可能具有類雌激素作用.其作用途徑可能是通過提高去卵巢小鼠海馬中AChE活性，從而改善海馬膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，提高動物的學(xué)習(xí)能力.五味子改善去卵巢小鼠學(xué)習(xí)能力的有效成分及其作用仍有待進(jìn)一步深入研究.

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Keywords： Schisandra extracts; ovariectomized mice; behavioral learning; acetylcholinesterase

【責(zé)任編輯 成 文】

EFFECTSOFSCHISANDRAONBEHAVIORALLEARNINGANDHIPPOCAMPALAChEACTIVITYINOVARIECTOMIZEDMICE

XIE Xun, YANG Meiyan, WU Bozhi, YAO Lihua, LI Chuhua*

(School of Life Science, Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology of Plant Development,South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The effects of different extracts of Schisandra on behavioral learning in ovariectomized mice and the correlative mechanisms were studied by experiments. Different fractions of Schisandra alcohol extract were obtained with different polarities of solvents. Ovariectomized mice were orally given the different medication for 28 d. The behavioral learning of mice were mensurated in Model MG-2 maze. AChE activity in hippocampus was determined by ultraviolet spectrometry. The behavioral learning of ovariectomized mice were impaired significantly and the activity of AChE was depressed in hippocampus compared with that of the control group. Schisandra n-butanol extract and ethanol extract both enhanced the behavioral learning ability of ovariectomized mice. The n-butanol extract significantly elevated the hippocampal activity of AChE in ovariectomized mice. The results indicated that the effect of Schisandra n-butanol extract is better than that of the ethanol extract. The effective components of Schisandra on learning improvement is concentrated in the n-butanol extract, which may be contributed with the activity of AChE in hippocampus.

2009-11-20

謝珣(1984—)，女，廣東潮州人，華南師范大學(xué)2007級碩士研究生，Email：susanxie200709@yahoo.com.cn；李楚華(1970—)，女，廣東省揭陽市人，博士，華南師范大學(xué)副教授、碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥效藥理研究，Email: lich@scnu.edu.cn.

*通訊作者

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