豬瘟病毒E2蛋白部分抗原區(qū)基因在原核系統(tǒng)的分泌表達(dá)與鑒定

周 順 ，李 俊 ，溫建新

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100）

豬瘟，也叫古典豬瘟，是由豬瘟病毒（HCV或CSFV）引起的豬的一種急性、熱性、接觸性傳染病。自從1883年在美國(guó)俄亥俄州首次發(fā)生以來(lái)，豬瘟在世界許多國(guó)家和地區(qū)時(shí)有暴發(fā)和流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病[1]。1885年Salmom和Smith對(duì)豬瘟病原體和豬沙門(mén)氏菌等豬的一些病原體進(jìn)行了鑒別診斷，1903年De Shweinitz和Dorset的研究表明，豬瘟是由病毒引起的。迄今為止，該病在南美和亞洲地區(qū)仍有發(fā)生和流行，歐洲少部分地區(qū)也時(shí)有發(fā)生。豬瘟仍然是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，是我國(guó)主要的畜禽疫病之一。目前該病流行于除北美和大洋洲外的世界上各大洲和地區(qū)[2]，因此各國(guó)都在致力于豬瘟的研究、控制與撲滅工作。我國(guó)從70年代開(kāi)始，由于成功研制出C株兔化弱毒疫苗并大力推廣應(yīng)用，使得豬瘟在我國(guó)得到有效控制[3]。但是由于近20多年來(lái)，豬瘟的流行與發(fā)病發(fā)生了一些變化，溫和型（非典型）豬瘟的發(fā)生日益普遍，加上一些疾病的繼發(fā)感染或混合感染[4-6]，加大了豬瘟診斷的難度，即使是采用實(shí)驗(yàn)室的診斷手段，一般檢測(cè)抗體的方法[7-9]也不易對(duì)豬瘟進(jìn)行確診。由于多年來(lái)疫苗研究方面沒(méi)有取得突破性的進(jìn)展，使得豬瘟的防制工作不盡人意，甚至豬瘟在有些地區(qū)還有抬頭的趨勢(shì)，因此豬瘟仍然是威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)特別是規(guī)?；B(yǎng)豬的重要傳染病。

豬瘟病毒是黃病毒科瘟病毒屬成員，其囊膜糖蛋白E2是其主要保護(hù)性抗原蛋白，能夠單獨(dú)誘導(dǎo)有效的免疫保護(hù)反應(yīng)[10]。該蛋白從多聚蛋白的690位氨基酸到1 061位，共包括371個(gè)氨基酸殘基，包含6個(gè)半胱氨酸，其中693和737形成一對(duì)二硫鍵，以此為基礎(chǔ)形成了一個(gè)獨(dú)立的抗原表位集中的B區(qū)和C區(qū)；而792和857、818和828形成了另一個(gè)獨(dú)立的抗原表位集中的A區(qū)和D區(qū)[11-12]，B/C區(qū)基因序列在各CSFV毒株中極其保守而在黃病毒屬其它成員，如BVDV和BDV中變異很大[13-14]，所以表達(dá)產(chǎn)物作亞單位疫苗時(shí)能產(chǎn)生針對(duì)各豬瘟病毒毒株的保護(hù)性抗體，可以用于血清學(xué)方法監(jiān)測(cè)抗體水平，故用其表達(dá)產(chǎn)物作診斷抗原時(shí)比選擇A/D區(qū)的表達(dá)產(chǎn)物有更大的特異性?xún)?yōu)勢(shì)。養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國(guó)家已有利用重組表達(dá)的E2蛋白作亞單位疫苗和建立了對(duì)應(yīng)其豬瘟防疫政策的檢測(cè)豬群豬瘟抗體陰陽(yáng)性的ELISA方法[15]。因此本研究選取了E2基因中編碼1到76位氨基酸的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增表達(dá)，以期用重組表達(dá)E2蛋白或其主要的抗原域，作為檢測(cè)抗原和亞單位疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒與血清、豬瘟兔化弱毒、高免血清及陰性血清、表達(dá)載體PET30（a）、受體菌BL21由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；PMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及各種修飾酶購(gòu)自Takara公司；IPTG、卡那霉素、PEG6000、MW8000纖維素透析袋購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純品。

1.2 引物的設(shè)計(jì)及合成

擴(kuò)增含編碼B/C抗原區(qū)的基因片段所用的引物：上游：5'-tcgaattcatg cgtctagcctgca-3'、下游：5'-tggtgagtgag taaagcccccttat-3'，送上海生工生物工程有限公司合成。上、下游引物分別包含設(shè)計(jì)為Eco RI、Pst I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增E2基因的第1位氨基酸至第76位氨基酸。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病毒RNA的提取和B/C基因的RT-PCR擴(kuò)增

RNA的提取按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)GeneBank中豬瘟病毒設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)B/C基因的特異性引物（見(jiàn)上），反轉(zhuǎn)錄按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取5μL cDNA產(chǎn)物用作PCR模板，將PCR產(chǎn)物經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

1.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物膠回收后，與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化后得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為T(mén)B/C。利用上游引物的酶切位點(diǎn)和載體上的酶切位點(diǎn)，雙酶切后回收B/C基因和同樣處理的原核表達(dá)載體進(jìn)行T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化BL21菌種制備的感受態(tài)細(xì)胞。小量提取質(zhì)粒。雙酶切篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為PETB/C。將PETB/C送上海博亞生物公司測(cè)序。

1.3.3 PCR陽(yáng)性菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有重組質(zhì)粒PETB/C的BL21菌種在含卡那霉素的LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，于含卡那霉素的LB中37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.6~0.7時(shí)加入IPTG至終濃度1 mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)3~6 h，收獲細(xì)菌。離心后將菌體用0.5 M NaCl、20 mM Tris·Cl（pH=7.6）洗兩次，然后用PBS懸浮細(xì)胞，經(jīng)超聲波裂解后，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮蘭染色，觀察結(jié)果。

1.3.4 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE和免疫學(xué)鑒定

直接取上清進(jìn)行SDS-PAGE（5%的濃縮膠，15%分離膠），將表達(dá)上清中蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用豬瘟兔化弱毒高免血清進(jìn)行Western-blot分析。

1.3.5 間接ELISA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗原性

將濃縮的重組表達(dá)上清及對(duì)照（空菌上清）用包被液在96孔板上倍比稀釋?zhuān)?℃包被過(guò)夜，分別用豬瘟兔化弱毒高免血清和陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，稀釋倍數(shù)為1:200，二抗按說(shuō)明稀釋?zhuān)?:5 000），底物為 TMB，用 0.15%HF終止反應(yīng)，最后用標(biāo)儀讀取OD630值。選用可與陽(yáng)性血清反應(yīng)出現(xiàn)明顯反應(yīng)且與陰性血清無(wú)反應(yīng)的抗原稀釋度作為抗原用量用于檢測(cè)待檢血清中的豬瘟抗體。同時(shí)對(duì)其他8種疫病陽(yáng)性血清（豬瘟陰性血清）做間接ELISA試驗(yàn)。

1.3.6 表達(dá)蛋白的初步應(yīng)用

隨機(jī)從山東、哈爾濱等地的送檢血清中選擇了58份血清，將表達(dá)的B/C蛋白按上述確定的反應(yīng)量與待檢的血清進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，同時(shí)用Dot-ELISA試驗(yàn)結(jié)果作為參照，分析其相符性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 編碼E2蛋白B/C區(qū)特定基因的擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳后在DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的250 bp附近出現(xiàn)了一條明顯的條帶，符合預(yù)期設(shè)計(jì)的261 bp大小的片段（圖1）。

2.1.2 陽(yáng)性質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

質(zhì)粒經(jīng)用Eco RI和Pst I雙酶切處理后，8 g/L瓊脂糖上電泳，可見(jiàn)在DL2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)250 bp、500 bp之間出現(xiàn)符合預(yù)期設(shè)計(jì)大小的目的片段和大于2 000 bp的載體帶（圖2）。

2.1.3 陽(yáng)性質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

質(zhì)粒經(jīng)用Eco RI和SacⅡ雙酶切雙酶切處理后，8 g/L瓊脂糖上電泳，可見(jiàn)在DL2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)250 bp、500 bp之間出現(xiàn)符合預(yù)期設(shè)計(jì)大小的目的片段和大于2 000 bp的載體帶（圖3）。

2.2 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE和免疫學(xué)鑒定結(jié)果

誘導(dǎo)72 h樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，可見(jiàn)一條大小為9 kDa的條帶，與預(yù)期的9.0 kDa相符合（圖4）。在Werstern-blot中結(jié)果有明顯的雜交帶而對(duì)照組雜交呈陰性，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物能與豬瘟抗血清特異性結(jié)合（圖5）。

2.3 間接ELISA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗原性

用包被液稀釋重組表達(dá)上清與豬瘟兔化弱毒高免血清呈陽(yáng)性反應(yīng)，OD630從1:24開(kāi)始下降，但直到1:27仍然與豬瘟兔化弱毒高免血清陽(yáng)性反應(yīng)，而空白菌體的誘導(dǎo)上清呈陰性反應(yīng)（OD630≤0.2）。說(shuō)明重組表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性，可以區(qū)分豬瘟陰陽(yáng)性血清和用于抗體水平的檢測(cè)。

2.4 與Dot-ELISA對(duì)比試驗(yàn)

隨機(jī)從山東、哈爾濱等地的送檢血清中選擇了40份血清，將表達(dá)的蛋白按適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)量與待檢的血清進(jìn)行上述試驗(yàn)，同時(shí)用Dot-ELISA試驗(yàn)結(jié)果作為參照，結(jié)果其相符性達(dá)95%左右。

3 討論

近年來(lái)，國(guó)外對(duì)豬瘟病毒的研究?jī)?nèi)容逐漸加深。豬瘟病毒是豬急性傳染病以及免疫抑制等方面的一個(gè)主要誘因。如何對(duì)豬瘟進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)也成為科研工作者和養(yǎng)殖戶(hù)所關(guān)心的重要問(wèn)題。利用傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)的病毒分離方法診斷豬瘟不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且也不容易操作。而常用的HA試驗(yàn)不僅其敏感度低，而且因豬血清中含有非特異性紅細(xì)胞凝集物質(zhì)和非特異性血凝抑制物質(zhì)，故在診斷中還需要先進(jìn)行預(yù)處理，使操作過(guò)程復(fù)雜化[16-17]。此外，利用全病毒作抗原建立的診斷方法必須先將病毒濃縮提純，然后再用去污劑裂解后并適當(dāng)濃縮才能用作抗原，這就使得全病毒抗原制備過(guò)程復(fù)雜，不宜于推廣。而且利用全病毒抗原作為診斷用抗原，在對(duì)以HA為基礎(chǔ)的亞單位疫苗或病毒活載體疫苗免疫豬血清的診斷中，不能起到鑒別診斷疫苗免疫豬和野毒感染豬血清的作用。

豬瘟B/C蛋白是其保守性蛋白，是豬瘟病毒診斷最具代表性的蛋白。利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白已在分子免疫學(xué)、亞單位疫苗、蛋白與蛋白、蛋白與DNA的相互作用中得到了廣泛的應(yīng)用。而選用合適的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)診斷用抗原也是一種新型的方法。利用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的抗原其反應(yīng)原性一般不會(huì)喪失，可以直接用于病毒感染的檢測(cè)，而且所表達(dá)的蛋白一般都融合了一定的標(biāo)簽以方便蛋白的純化。我們選用的PET30就是帶有組氨酸標(biāo)簽的一種原核表達(dá)系統(tǒng)，所以所表達(dá)的重組B/C也非常方便純化。如今豬瘟的檢測(cè)手段中HA試驗(yàn)其敏感度都較低，而較敏感的ELISA等檢測(cè)方法尚未建立，如果能將重組的蛋白進(jìn)行純化，然后作為抗原，組裝成重組B/C的間接ELISA診斷試劑盒，其敏感性將會(huì)有很大的提高。而且因?yàn)橹亟M蛋白純化后其純度可已達(dá)到很高，所以特異性也非常有保證。對(duì)我國(guó)豬瘟的診斷必將帶來(lái)極大的方便。在豬瘟病毒NP蛋白的表達(dá)過(guò)程中，所表達(dá)的蛋白大小約為9 KD，在對(duì)送檢血清樣品的檢測(cè)中也充分證實(shí)了重組蛋白具有非常好的生物學(xué)活性。在實(shí)驗(yàn)室工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)送檢樣品的檢測(cè)，利用重組蛋白建立的間接ELISA診斷方法特異性高，敏感性也可以滿(mǎn)足需要，能夠?qū)ξ覈?guó)豬瘟的流行病學(xué)調(diào)查或感染豬場(chǎng)的豬瘟病毒診斷奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)，希望能盡快得到推廣。

[1]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：科技出版社，1997：652-664.

[2]涂長(zhǎng)春.豬瘟國(guó)際流行態(tài)勢(shì)、我國(guó)現(xiàn)狀及防制對(duì)策 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（8）：955-960.

[3]王鎮(zhèn)，丁明孝.豬瘟病毒致病機(jī)制及防制的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，29（5）：449-454.

[4]魏玉明.仔豬水腫病和豬瘟混合感染的診斷和防制[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22（5）：389-390.

[5]魏玉明.仔豬偽狂犬病與豬瘟混合感染的診斷和防制[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2001，31（1）：35.

[6]黎江，李軍，余艷娟，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和副豬嗜血桿菌的混合感染[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（11）：123-124.

[7]畢保良，李進(jìn)濤，旭川，等.分子生物學(xué)技術(shù)在豬瘟診斷中的應(yīng)用 [J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（2）：106-108.

[8]傅義娟，王生祥，張立成.豬瘟的診斷與防治[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006，42（9）：55.

[9]王華，王君瑋，徐天剛，等，非洲豬瘟流行病學(xué)和診斷方法的研究進(jìn)展.[J]. 中 國(guó) 獸 醫(yī) 科 學(xué) ，2008，38（6）：544-548.

[10]Konig M，Lengsfeld T，Pauly T.Classical swine fever virus（CSFV）independent induction of protective immunity by two structural glycoproteins[J].Virol，1995，69（10）：6479-6486.

[11]Van rijn P A，Van gennip H G P，De meijer E J，etal.Epitope mapping of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus strain Brescia[J].Gen Virol，1993，74：2053-2060.

[12]Van rijn P A，Miedema G K W，Wensvoort G，et al.Antigenic structure of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus [J].Virol，1994，75：3934-3942.

[13]Dong X N，Wei K，Zu Q，et al.Candidate peptide vaccine induced protection against classical swine fever virus[J].Vaccine，2002，21：167-173.

[14]Vanrijn P A，Van gennip H G P，Leendertse，et al.Subdivision of the pestivirus genus based on envelope glycoprotein E2 [J].Virology，1997，23（2）：337-348.

[15] Colijn E，Bloemraad M，Wensvoort G.An improved ELISA for the detection of serum antibodies directed against classical swine fever virus[J].Vet Microbiol，1997，59：15-25.

[16]Astrid V，Guillaume S.Comparison of three non-nested RT-PCR for the detection of influenza A viruses[J].Clin Virol，2000.17（3）：167-175.

[17]Swenson S L，Vincent L L.A compsrison of diagnostic assay for the detection of type A swine influenza virus from nasal swabs and lungs[J].VetDiagn Invest，2001，13（1）：36-42.