高溫環(huán)境下急性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌HSP70及血漿心鈉素的影響

李愛萍 崔書強(qiáng) 徐金成 高頎 趙杰修

1北京體育大學(xué)（北京 100084） 2國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所

許多研究證明，高溫和運(yùn)動(dòng)均可以誘導(dǎo)心肌組織HSP70表達(dá)[1-3]。HSP70的高表達(dá)有利于機(jī)體組織對(duì)抗損傷，進(jìn)而對(duì)機(jī)體組織的損傷進(jìn)行一定的修復(fù)。心臟既是循環(huán)動(dòng)力器官同時(shí)也是內(nèi)分泌器官，其分泌的心鈉素可以調(diào)節(jié)體液平衡維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。血漿心鈉素的升高是機(jī)體的一種保護(hù)性代償反應(yīng)，可以改善組織中血液供應(yīng)，防止血壓過(guò)度升高。運(yùn)動(dòng)對(duì)血漿心鈉素（ANP）的影響不僅和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度有關(guān)，還和訓(xùn)練程度及運(yùn)動(dòng)時(shí)間密切相關(guān)。因?qū)嶒?yàn)條件的不同，有關(guān)高溫對(duì)血漿心鈉素影響的研究結(jié)果也并不一致[4]。目前有關(guān)高溫環(huán)境下急性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體HSP70和血漿心鈉素影響的研究鮮有報(bào)道，因此本研究觀察了在高溫環(huán)境下進(jìn)行急性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌組織HSP70的表達(dá)和血漿心鈉素的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley大鼠60只，8周鼠齡，體重230～250克，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK（京）2007-0001，級(jí)別:清潔級(jí)。在動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，每籠5只。室溫調(diào)節(jié)為23℃±1℃，相對(duì)濕度50%±5%，每日采用燈光照明，12小時(shí)晝夜節(jié)律變化。動(dòng)物滅菌墊料和標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物維持期標(biāo)準(zhǔn)滅菌飼料購(gòu)于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2005-0007。滅菌水飼養(yǎng)，大鼠籠內(nèi)自由飲食飲水，墊料酌情兩天更換一次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 適應(yīng)訓(xùn)練和動(dòng)物分組

60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1天后，根據(jù)文獻(xiàn)[5]，均進(jìn)行6天適應(yīng)性遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練。跑臺(tái)起始速度為15米/分鐘，訓(xùn)練30分鐘，第2天速度增加到為20米/分鐘，訓(xùn)練30分鐘，第3天開始速度每日增加2米/分鐘，訓(xùn)練時(shí)間每日增加5分鐘，到第6天跑臺(tái)速度逐漸增加到28米/分鐘，訓(xùn)練時(shí)間增加到60分鐘。

訓(xùn)練后經(jīng)篩選，挑選符合運(yùn)動(dòng)條件的大鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。將篩選后符合運(yùn)動(dòng)條件的48只大鼠隨機(jī)分為6組:安靜對(duì)照組（C組，294.3±11.5g）、運(yùn)動(dòng)后即刻組（E組，295.2±10.4g）、高溫運(yùn)動(dòng)后即刻組（HE 組，292.6±9.9g）、高溫暴露1小時(shí)后即刻組（H組，298.8±8.7g）、運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)恢復(fù)組（E’組，287.8±14.9g）和高溫運(yùn)動(dòng)后 24小時(shí)恢復(fù)組（HE’組，289.1±14.26g），每組 8只，各組大鼠體重之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

1.2.2 正式實(shí)驗(yàn)方案

第6天訓(xùn)練后，所有大鼠均休息24小時(shí)。于第8天開始進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)。采用國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所的高溫高濕低氧環(huán)境實(shí)驗(yàn)房控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度和濕度。安靜對(duì)照組大鼠于動(dòng)物房中飼養(yǎng)。E組及E’組大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度為0，速度為28m/min，周圍環(huán)境溫度為23℃，相對(duì)濕度為50%。HE組及HE’組大鼠也進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度為0，速度為 28m/min，周圍環(huán)境溫度為33℃，相對(duì)濕度為50%。H組于周圍環(huán)境溫度33℃、相對(duì)濕度50%的條件下暴露1小時(shí)。力竭標(biāo)準(zhǔn)為大鼠跟不上跑臺(tái)跑速，不能堅(jiān)持原跑速，滯留、俯臥在跑道后格柵處30秒以上，木棍等輕微刺激驅(qū)趕無(wú)效。在運(yùn)動(dòng)中盡量減少人為以及外界光電等因素對(duì)大鼠的刺激。

1.2.3 取材與測(cè)試

安靜組、運(yùn)動(dòng)后即刻組、高溫運(yùn)動(dòng)后即刻組及高溫暴露1小時(shí)組均在力竭運(yùn)動(dòng)后即刻宰殺。運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)恢復(fù)組和高溫運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)恢復(fù)組均在室溫下恢復(fù)24小時(shí)后宰殺。采用數(shù)字溫度計(jì)（北京司南儀器廠）測(cè)量大鼠運(yùn)動(dòng)前后的肛溫，以代表大鼠的核心體溫。記錄大鼠運(yùn)動(dòng)到力竭的時(shí)間。

2%戊巴比妥鈉按照0.25ml/100g體重劑量進(jìn)行腹腔麻醉，待大鼠麻醉后，固定好四肢，剖開腹腔，暴露內(nèi)臟，選取腹主動(dòng)脈取血，其中1ml放入事先放好抑肽酶和EDTA的離心管中，4℃、3800轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心，留取上清，置于－70℃保存待測(cè)心鈉素。其余血液室溫靜置后37℃水浴20分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心25分鐘后分離血清，分裝后置于－70℃保存待測(cè)CK-MB。同時(shí)在冰盤上取出大鼠心臟，實(shí)驗(yàn)中由同一人分離左右心房與左右心室，錫紙包裹，液氮急凍，分裝后－70℃保存，取左心室待測(cè)HSP70。

在每組8個(gè)樣本中隨機(jī)選取6個(gè)樣本，采用Western blotting方法測(cè)試大鼠左心室肌 HSP70。一抗為[ABCAM Mouse monoclonal[BRM-22]（ab6535）]、HRP 二抗（ZB-2301，北京中杉）。心鈉素放免試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所，采用放免法測(cè)試大鼠血清心鈉素含量。CK-MB購(gòu)自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司，采用速率法測(cè)試。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各指標(biāo)數(shù)值均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用析因方差分析方法分析實(shí)驗(yàn)中因素的作用，對(duì)有顯著性作用的因素，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間

運(yùn)動(dòng)后即刻組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間為148.6±25.5分鐘，運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)恢復(fù)組為130±24.1分鐘，二者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；高溫運(yùn)動(dòng)后即刻組為52±14.6分鐘，高溫運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)恢復(fù)組為48±10.7分鐘，二者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；運(yùn)動(dòng)后即刻組與高溫運(yùn)動(dòng)后即刻組力竭時(shí)間有顯著性差異（P<0.01）。運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)恢復(fù)組與高溫運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)恢復(fù)組力竭時(shí)間有顯著性差異（P<0.01）。

2.2 溫度和運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌組織HSP70、血漿ANP，血清CK-MB的影響

析因分析（表1）顯示，溫度對(duì)心肌組織HSP70表達(dá)有顯著影響，運(yùn)動(dòng)時(shí)程對(duì) HSP70、ANP、CK-MB表達(dá)均有顯著影響，但上述兩個(gè)因素對(duì)三指標(biāo)的影響無(wú)交互作用。

表1 溫度和運(yùn)動(dòng)對(duì)HSP70、ANP、CK-MB表達(dá)的影響

HSP70表達(dá)量如圖1和表2所示:與C組相比，E組和 E’組 HSP70表達(dá)量顯著升高（P<0.05，P<0.01）；HE’組顯著高于H組（P<0.01）。HE組與H組、HE’組之間，E’組與E組之間均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。H組顯著高于 C 組（P<0.01）。HE’組顯著高于 E’組（P<0.01）。高溫與運(yùn)動(dòng)的聯(lián)合作用有使蛋白表達(dá)增加的趨勢(shì)，但二者的協(xié)同作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組心肌組織HSP70表達(dá)比較

由析因分析可知，溫度對(duì)不同組別大鼠血漿心鈉素?zé)o顯著影響。單因素方差分析結(jié)果如表3所示，與C組比，E組顯著升高（P<0.01）；HE組顯著高于 H組（P<0.01）；E’組和HE’組分別比 E組和HE組顯著降低（P<0.01）。E’組與C組相比無(wú)顯著性差別，HE’組與H組相比無(wú)顯著性差別。

表3 各組血漿ANP及血清CK-MB的表達(dá)比較

與C組相比，E組血清 CK-MB顯著升高（P<0.01），HE組顯著高于H組（P<0.05）。而溫度對(duì)CK-MB無(wú)顯著性影響。E’組顯著低于C組（P<0.05）和E組（P<0.01），HE’組顯著低于 HE組（P<0.01）。

3 討論

很多研究表明，誘導(dǎo)型HSP70（HSP72）僅分布在應(yīng)激細(xì)胞中，受到應(yīng)激時(shí)大量表達(dá)以對(duì)抗各種應(yīng)激。HSP70是機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，可以對(duì)抗多種應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的損傷，被認(rèn)為是抗損傷蛋白，參與損傷修復(fù)過(guò)程，而且多種條件都可誘導(dǎo)HSP70[6]。有報(bào)道顯示，只有在跑速大于等于24m/min的情況下心肌組織HSP70表達(dá)量才顯著升高[1]。而且心肌組織中HSP70的基礎(chǔ)表達(dá)與訓(xùn)練程度呈正相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)采用28m/min的跑速運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致了E組和H組心肌HSP70表達(dá)顯著高于C組，提示溫度誘導(dǎo)了熱休克蛋白大量增加，這與其它研究結(jié)果一致[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HE組HSP70表達(dá)雖比E組有所升高，但無(wú)顯著差異，HE’組在24小時(shí)恢復(fù)后顯著高于E’組，提示高溫環(huán)境可能增強(qiáng)了力竭運(yùn)動(dòng)引起的HSP70高表達(dá)，從而對(duì)抗各種應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的損傷。

血漿心鈉素可以調(diào)節(jié)和緩沖運(yùn)動(dòng)中血壓的變化，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，擴(kuò)張血管以增加心肌和運(yùn)動(dòng)肌肉中血液供應(yīng)，促進(jìn)有氧耐力水平[9－11]，改善心肌功能。研究表明，一次性力竭運(yùn)動(dòng)大鼠和耐力訓(xùn)練后再進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)后血漿心鈉素均顯著升高，提示力竭運(yùn)動(dòng)造成了心肌組織缺血[12]。本實(shí)驗(yàn)未直接觀察心肌組織形態(tài)變化，但血清CK-MB被認(rèn)為是心肌損傷的標(biāo)志。Ohba等的研究也表明，血漿心鈉素含量過(guò)度增高提示有潛在性心肌受損的可能[13]。本實(shí)驗(yàn)中，E組CK-MB水平顯著增加，E組和HE組心鈉素水平分別顯著高于C組和H組，提示運(yùn)動(dòng)造成心鈉素水平顯著增加，故推測(cè)這可能可以改善心肌血液供應(yīng)，但同時(shí)也存在心肌受損的潛在可能[14]。HE組心鈉素水平與E組無(wú)顯著性差異，提示高溫環(huán)境并未增強(qiáng)力竭運(yùn)動(dòng)所致的心鈉素水平的增加，這可能和HE組運(yùn)動(dòng)時(shí)間較短有關(guān)。24小時(shí)后E’組和HE’組心鈉素水平分別顯著低于E組和HE組，推測(cè)可能隨著24小時(shí)后HSP70表達(dá)水平的增加，HSP70參與了損傷修復(fù)，緩解了心肌組織受損程度，因而心鈉素水平有所降低。

4 總結(jié)

高溫和運(yùn)動(dòng)均會(huì)誘導(dǎo)心肌HSP70高表達(dá)且24小時(shí)后表達(dá)最高，高溫環(huán)境增強(qiáng)了力竭運(yùn)動(dòng)引起的HSP70高表達(dá)，這可能對(duì)高溫及運(yùn)動(dòng)后造成的心肌損傷有一定的修復(fù)作用。力竭運(yùn)動(dòng)即刻血漿心鈉素升高，改善了心肌血液供應(yīng)，但同時(shí)也提示心肌有潛在受損的可能，但高溫環(huán)境并未加強(qiáng)力竭運(yùn)動(dòng)所致的心鈉素水平的增加。

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