中等強度跑臺運動和雌激素對去卵巢大鼠肝臟NO含量及eNOS和iNOS表達的影響

卜淑敏 王怡婧 張焱

首都體育學院（北京 100088）

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種重要的信使分子，在循環(huán)、呼吸、消化及內(nèi)分泌等系統(tǒng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。婦女絕經(jīng)后因卵巢功能衰退，雌激素（estrogen，E2）分泌減少，易患絕經(jīng)綜合癥[2]。研究表明，無論是絕經(jīng)后的婦女還是去卵巢后的大鼠，其血清NO水平均顯著下降，而雌激素替代療法和中等強度運動均能通過增加血清和/或組織NO水平而對絕經(jīng)后婦女和去卵巢大鼠的心血管實施保護作用[3-6]。由于血清中生理劑量的NO主要來源于血管內(nèi)皮細胞和肝細胞[7]，本實驗采用目前國內(nèi)外普遍使用的模擬女性絕經(jīng)綜合癥及其相關疾病的去卵巢大鼠模型[8]，觀察中等強度跑臺運動和E2對去卵巢大鼠肝組織勻漿NO含量及肝組織eNOS和iNOS蛋白表達的影響，為深入探討運動和E2改善絕經(jīng)綜合癥的機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

17β-estrodial（E2）:Sigma公司；速眠新注射液（麻醉劑）:中國人民解放軍農(nóng)牧大學軍事獸醫(yī)所研究產(chǎn)品；一氧化氮試劑盒:南京建成生物工程有限公司。Rabbit-anti-NOS2（N-20，sc-651）和 Rabbit-anti-NOS3（C-20，sc-654）:Santa Cruz Biotechnology；辣根酶標記鏈酶卵白素、山羊抗兔IgG/生物素標記和DAB顯色試劑盒:北京中杉金橋生物技術有限公司；DSPT-202小動物跑臺:杭州段氏制造廠生產(chǎn)；721分光光度計:上海光華儀器廠；LG10-3A離心機:北京離心機廠。

1.2 實驗動物手術和分組

健康3月齡雌性SD大鼠60只，體重（230±15）g。購自并在北京維通利華實驗動物有限公司飼養(yǎng)[合格證號:SCKK（京）2006-0008]。適應飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為假手術組（20只）和手術組（40只）。兩組大鼠均禁食12h，腹腔注射速眠新（0.7ml/kg）麻醉，手術組從背部切除雙側(cè)卵巢，假手術組不切除卵巢，而將卵巢旁與卵巢等大的脂肪組織切除。1周后按體重將手術組大鼠又隨機分為去卵巢靜止組、去卵巢運動組、去卵巢加雌激素（E2）組和去卵巢運動加雌激素（去卵巢運動加E2）4個組，同時將假手術組又分為假手術靜止組和假手術運動組2個組。各組大鼠同等條件飼養(yǎng)，在實驗過程中，有5只大鼠先后在后續(xù)處理過程中死亡，最后納入實驗的各組大鼠的數(shù)目分別為:假手術組9只、假手術運動組10只、去卵巢組 9只、去卵巢運動組10只、去卵巢加 E2組8只、去卵巢運動加E2組9只。

1.3 運動訓練和E2注射方案

跑臺運動訓練和E2注射方案均參考相關文獻報道并進行適當調(diào)整[9]。手術后第2周，各運動組大鼠在小動物跑臺上開始適應訓練1周，時間從第1天的15min逐漸增加到第5天的60min。正式運動訓練期為12周，每周5次，每次 60min，速度 18m/min，坡度為 0。去卵巢加E2組和去卵巢運動加E2組大鼠每周頸部皮下注射3次E2，每次注射劑量為50μg/kg體重。運動訓練和藥物處理均在每天上午固定時間進行，每周稱量大鼠體重一次，根據(jù)體重調(diào)整E2的注射劑量。

1.4 取材

末次運動與藥物處理24小時后，用速眠新麻醉，腹主動脈取血后斷頭處死，處死前斷食12小時。迅速取大鼠肝臟置于預冷的生理鹽水中洗凈血污，切取相同部位2mm×2mm×2mm的組織塊立即置于預先備好的4%的多聚甲醛溶液中固定以備免疫組化檢測；其余組織用濾紙吸干后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 肝臟勻漿液NO的測定

稱取100mg肝臟，加1ml 0.86%的生理鹽水，在玻璃勻漿器中勻漿制成10%勻漿液。采用亞硝酸還原酶法測定肝臟勻漿液中的NO含量，所有操作均依照試劑盒說明書的步驟進行。

1.6 免疫組化檢測

將石蠟包埋的組織切成5μm厚的切片，二甲苯及梯度乙醇脫臘復水。10%羊血清37℃封閉1h后，加入抗人NOS2和NOS3一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3次。加入生物素標記的羊抗兔二抗，37℃孵育 30min，1×PBS洗 3次。加入辣根酶標記的鏈親合素，37℃孵育30min，PBS洗3次。DAB試劑盒室溫顯色10～20min后，蘇木素復染1min，用梯度乙醇和二甲苯脫水，中性樹膠封片后，Olympus顯微鏡下觀察及拍照。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果以平均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（F檢驗），若方差齊性，則采用t檢驗，若非齊性，采用t'檢驗，P<0.05被認為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 肝組織勻漿NO含量

表2顯示，與假手術組相比，假手術運動組肝組織勻漿NO含量顯著升高（P<0.05），去卵巢組肝組織勻漿NO含量顯著降低（P<0.05）；與去卵巢組相比，去卵巢運動組（P<0.05）、去卵巢加 E2組（P<0.05）和去卵巢運動加E2組（P<0.01）肝組織勻漿NO含量顯著升高，且去卵巢運動加E2組顯著高于去卵巢運動組和去卵巢加E2組。

表1 各組肝組織勻漿NO含量的比較Table 1 Comparison of the nitric oxide content of liver in all groups

2.2 肝臟eNOS蛋白表達

如圖1所示，eNOS主要定位在肝竇內(nèi)皮細胞及其周圍肝細胞胞漿中，其中，去卵巢運動組（圖1C）表達最低，去卵巢運動加E2組（圖1F）表達最高。從圖1可知，肝臟eNOS蛋白表達的變化趨勢與肝勻漿NO含量變化趨勢 基本相同。

2.3 肝臟iNOS蛋白表達

如圖2所示，在假手術組（圖 2A1、A2）、假手術運動組（圖 2B1、B2）、去卵巢加 E2組（圖 2E1、E2）和去卵巢運動加E2組（圖2F1、F2）中，iNOS主要在肝細胞胞質(zhì)中表達；在去卵巢組（圖 2C1、C2）和去卵巢運動組（圖 2D1、D2）中，iNOS既在胞質(zhì)中表達，又在胞核中表達。從圖2A1、B1、C1、D1、E1、F1 可知，肝臟 iNOS 蛋白表達變化不明顯。

3 討論

圍絕經(jīng)期婦女由于卵巢功能的逐漸衰竭都患有程度不等的絕經(jīng)綜合癥，給其生活和工作帶來諸多不便。雌激素替代和運動療法均能改善絕經(jīng)婦女的絕經(jīng)綜合癥癥狀，但目前對其作用機制還不十分清楚[2]。NO是一種廣泛存在的無機自由基，它既可以作為第一信使，又可以作為第二信使，還可以作為逆信使，在體內(nèi)發(fā)揮重要的細胞信號傳遞效應[1]。Zaros等人報道[3]，為期 6 個月的體育鍛煉能顯著增加患有高血壓的絕經(jīng)后婦女血清NO含量；同樣，Bednarek-Tupikowska等人的研究結(jié)果表明[4]，絕經(jīng)后婦女血清NO含量顯著低于未絕經(jīng)婦女，而經(jīng)4個月的E2治療后，絕經(jīng)后婦女血清NO含量顯著增加。去卵巢動物是目前國內(nèi)外通用的模擬E2缺乏的理想動物模型[8]。Grundt等人報道[5]，大鼠去卵巢后，血清、尿和動脈中的NO水平均顯著下降，而給去卵巢大鼠補充生理劑量的E2（按照大鼠動情周期中E2的周期性波動規(guī)律補充外源性E2）后，其血清、尿以及動脈中的NO水平均顯著回升，提示生理劑量的E2能上調(diào)去卵巢大鼠血清、尿以及動脈中的NO水平。本實驗中，去卵巢組肝組織勻漿中的NO含量顯著低于假手術組，而E2組肝組織勻漿中的NO含量顯著高于去卵巢組。此結(jié)果與Xu等人[10]在肝纖維化大鼠（用四氯化碳處理后的大鼠）和Sakamoto[11]等人在體外培養(yǎng)的肝竇細胞上報道的結(jié)果相似，提示E2能上調(diào)去卵巢大鼠肝臟合成NO。

研究表明，適宜的運動能通過增加體內(nèi)NO水平，達到舒張心血管、降低血壓等功效[12-15]。雖然生理劑量的NO主要由血管內(nèi)皮細胞和肝細胞合成[7]，但目前關于耐力運動對NO影響的研究主要集中在心血管內(nèi)皮細胞[12-15]、肌肉[16]等系統(tǒng)，而耐力運動對肝臟 NO 影響的報道較少。在肝臟中，已知肝竇內(nèi)皮細胞、枯否細胞、衛(wèi)星細胞、肝細胞均能產(chǎn)生NO，生成的NO不僅能調(diào)節(jié)肝竇微循環(huán)，保護肝臟免受酯質(zhì)過氧化毒害和纖維化，而且能通過血液循環(huán)增加血液中的NO水平，進一步調(diào)節(jié)其他組織器官的生理功能[17]。本研究中，中等強度跑臺運動不僅能顯著增加假手術大鼠肝組織勻漿NO含量，而且能顯著增加去卵巢大鼠肝組織勻漿NO含量，表明中等強度跑臺運動對大鼠肝組織勻漿NO含量的影響可能與E2的波動無關。此外，本實驗結(jié)果還表明，中等強度跑臺運動和E2能協(xié)同刺激去卵巢大鼠肝臟合成NO，至于二者是通過什么途徑單獨或協(xié)同刺激去卵巢大鼠肝臟合成NO還需進一步實驗證實。

機體內(nèi)NO是在NOS的作用下，由左旋精氨酸合成。已確認的NOS有三種，而肝組織內(nèi)僅有iNOS和eNOS兩型存在[18]。為探討中等強度跑臺運動和E2是通過調(diào)節(jié)哪種NOS上調(diào)去卵巢大鼠肝臟合成NO的，本實驗采用免疫組化方法，實驗結(jié)果表明，eNOS主要在各組大鼠肝竇內(nèi)皮細胞和肝竇周圍肝細胞的胞漿中表達，去卵巢、中等強度跑臺運動和E2均不影響其在肝細胞中的表達定位。而iNOS在肝細胞中的表達定位受E2調(diào)節(jié)。在假手術組，iNOS主要表達于肝細胞胞質(zhì)中，去卵巢后iNOS可由胞漿轉(zhuǎn)位到核中，注射E2可逆轉(zhuǎn)這種定位的變化。值得注意的是，先前 Goh 等[17]和 McNaughton 等[18]都在肝硬化患者肝臟切片中觀察到eNOS由胞漿中轉(zhuǎn)定位到核中的現(xiàn)象，查閱文獻尚未見iNOS表達轉(zhuǎn)位的報道。因此，E2如何調(diào)節(jié)大鼠iNOS的定位以及有何生理學意義有待進一步探討。

NO是一種小分子氣體，盡管其半衰期較短，但由于其透膜性非常好，所以其作用半徑往往比較大，組織局部極微量（pmol數(shù)量級）的NO即可起到正常生理作用。由于iNOS只在炎癥等病理狀態(tài)下表達，因此正常肝臟NO含量應與eNOS呈正相關。一般認為，eNOS合成的NO對肝臟有益，而iNOS合成的NO對肝臟有害[19]。孫紅梅報道[14]，適宜負荷的游泳訓練可以提高大鼠心肌與血清cNOS活性，而長時間過度負荷游泳訓練可使大鼠心肌與血清iNOS活性升高。黃臘秀等[6]在去卵巢大鼠心內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中的實驗結(jié)果表明，中等強度運動可上調(diào)去卵巢大鼠心內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞中nNOS的表達。從本實驗免疫組化結(jié)果分析，中等強度跑臺運動不僅能增加正常大鼠肝臟eNOS蛋白表達，而且能增加去卵巢大鼠肝臟eNOS蛋白表達，而對假手術和去卵巢大鼠肝臟iNOS表達均無明顯影響。這提示，本實驗選擇的運動強度可能是通過上調(diào)肝臟eNOS蛋白表達而不是iNOS的表達刺激肝臟NO合成，此運動強度對肝臟發(fā)揮的可能是保護作用。

4 總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)中等強度跑臺運動和E2單獨或聯(lián)合作用均能顯著增加去卵巢大鼠肝組織勻漿NO含量，二者可能是通過上調(diào)肝臟eNOS蛋白表達而發(fā)揮作用。

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