抗HIV-1gp120單克隆抗體的制備及鑒定

張永臣,文 劍,張 亮,趙 磊

(東南大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗科,江蘇 南京 210003)

艾滋病(AIDS)自1981年美國首次發(fā)現(xiàn)以來,在全世界迅速蔓延[1-3],對人類健康造成了極大威脅。全球流行的人類免疫缺陷病毒(HIV)根據(jù)血清反應(yīng)和病毒核酸序列可分為2型:HIV-1型和HIV-2型[4]。HIV-1型廣泛分布于世界各地,是引起全球AIDS流行的主要病原,所以目前HIV的研究主要集中在HIV-1型。HIV-1型的包膜糖蛋白(env)基因編碼gp160蛋白,進一步加工成gp120及gp41,具有較強的抗原性[5]。迄今為止,人類尚沒有治療或預(yù)防AIDS的特效藥物或疫苗,但研究證明抗體具有阻斷病毒入侵、中和病毒活性和抑制病毒復(fù)制的作用,為AIDS的治療帶來了希望。本文通過制備、鑒定抗HIV-1 gp120單克隆抗體,為進一步研制抗HIV治療性抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c小鼠購自上海斯萊克生物實驗動物中心;SP2/0小鼠骨髓瘤細胞系由本實驗室保存。

1.1.2 HIV-1 gp120基因片段 由衛(wèi)生部抗體技術(shù)重點實驗室朱進博士提供?；蛐蛄袨?5′-GATCCGGTGAACTGGACAAATGGGCAGGCCCGGGTCGTGCA TT CTACGAGCTGGATAAGTGGGCTGGTCCGGGCCGCG CTTTCTACA-3′和5′-TCGAGTGTAGAAAGCGCGGCCC GGACCAGCCCACTTATCCAGCTCGTAGAATGCACGACC CGGGCCTGCCCATTTGTCCAGTTCACC-3′。HIV-1 gp120抗原、HIV抗原硝酸纖維膜條由北京萬泰藥業(yè)公司提供。

1.1.3 主要試劑及工具酶類 Bam HⅠ內(nèi)切酶XhoⅠ內(nèi)切酶、核酸共沉淀劑、T4 DNA Ligase購自寶生物有限公司;Liagen膠回收試劑盒購自QIAquick公司;RPMI 1640干粉培養(yǎng)基購自Gibco公司;優(yōu)級新生牛血清購自明海生物工程有限公司;Supersignal West Pico Trial Kit、TMB Substrate Kit購自 Pierce 公司;小鼠Ig亞類檢測試劑盒、福氏佐劑及PEG、Hypoxanthine、Thymidine和Aminoptem購自Sigma公司。HIV-抗體診斷試劑盒購自上海科華生物有限公司,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自博士德有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定載體質(zhì)粒PEGX-4T-2用Bam HⅠ、XhoⅠ酶切,T4DNA Ligase連接 gp120基因片段,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-blue,送南京金思特科技有限公司測序。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入XL1-Blue大腸桿菌中,在IPTG誘導(dǎo)劑作用下25℃,190 r/min震蕩,過夜。4 000 r/min離心10 min,收集細菌。SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。

1.2.3 融合蛋白純化和鑒定表達產(chǎn)物離心收集沉淀經(jīng)PBS懸起,用30 W超聲粉碎儀裂解細菌后,將其離心收集上清過濾。濾液用AKTA PURIFYER 100蛋白純化儀、GST柱純化,得到融合蛋白GSTHIV,濃縮離心管進行濃縮,S21型生物分光光度計測量濃度。SDS-PAGE對純化蛋白進行鑒定。

1.2.4 動物免疫 BALB/c小鼠,6周齡,雌性,4只。第1次免疫加弗氏完全佐劑,100μg/只,腹腔注射。第2,3次免疫加弗氏不完全佐劑,腹腔注射。ELISA檢測血清效價達10-4時,加強免疫1次,200 μg/只,腹腔注射。3 d后進行細胞融合。

1.2.5 雜交瘤細胞株的建立 小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以1∶5在50%PEG作用下融合。用HAT篩選雜交瘤細胞,間接ELISA篩選陽性克隆,有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)建株。經(jīng)體外傳代培養(yǎng)及液氮凍存復(fù)蘇后,仍能穩(wěn)定分泌特異性抗體者表示建株成功。

1.2.6 單克隆抗體腹水的制備 10周齡BALB/c小鼠12只,每只小鼠腹腔注射降植烷0.3mL,1周后,腹腔注射6×105個/鼠雜交瘤細胞。8 d后,采集腹水,2 000 r/min離心10 min,去除油脂沉淀,吸取上清,-70℃保存。

1.2.7 單克隆抗體特性鑒定

1.2.7.1 Ig亞類鑒定和效價測定腹水用過濾離心法純化后,采用ELISA檢測試劑盒,按說明書操作,測定單抗的Ig亞類。腹水以常規(guī)ELISA法測定單抗效價。

1.2.7.2 Western blot檢測 HIV-1 gp120蛋白100℃,5 min做變性處理,制備電泳凝膠,進行SDSPAGE。將蛋白在300 mA,60 min,轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h,雜交瘤細胞培養(yǎng)上清為一抗,作用時間1 h,HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗,作用時間1 h,顯色后曝光。

1.2.7.3 重組免疫印跡分析(RIBA) 將HIV抗原硝酸纖維膜條放入槽中,將制備的單抗以1∶10稀釋后加入槽內(nèi),37℃孵育1 h,洗滌3次,將HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG加入槽內(nèi)37℃孵育1 h,洗滌3次,TMB顯色15 min,硫酸終止。檢測單抗與gp120,gp41,gp24,gp36,gp66,gp51,gp17是否反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將HIV-1 gp120基因片段插入到經(jīng)Bam HⅠ、XhoⅠ酶切處理后的PEGX-4T-2載體中,獲得PEGX-4T-2-HIV重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)測序,結(jié)果與預(yù)期一致。

2.2 重組蛋白的表達、純化及鑒定

通過SDS-PAGE檢測,在相對分子質(zhì)量(Mr)32 000左右有1條濃度很高的條帶,可以推測為HIV-1 gp120融合蛋白(見圖1)。分光光度法測得濃度為3.65mg/mL。

2.3 雜交瘤細胞株的建立

融合后獲4個陽性克隆,挑選2株吸光度值較高的陽性克隆進行亞克隆。經(jīng)2次亞克隆后獲得6株能穩(wěn)定分泌抗體的細胞,分別命名為4H1-A5-F3、4H1-1B6-G10、4H1-2B6-C2、4H1-2B6-G8、4HI-2B6-C5和4H1-E6-G9。經(jīng)體外傳代培養(yǎng)及液氮凍存復(fù)蘇后,仍能穩(wěn)定分泌特異性抗體。

2.4 單克隆抗體特性鑒定

經(jīng)Ig亞類ELISA試劑盒測定,雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及腹水中的抗體均為IgG1,細胞培養(yǎng)上清效價為2×10-3,腹水效價為5×10-5。

6株單克隆抗體皆只與gp120抗原反應(yīng),與gp41、gp24、gp36、gp66、gp51、gp17 無交叉反應(yīng) 。

Western blot分析結(jié)果表明,在Mr32 000左右可見1條明顯單一目的條帶。6株結(jié)果相同,列出其中2株細胞的條帶(圖2)。

3 討 論

AIDS是由HIV引起的一種致命性慢性傳染病。HIV侵犯和破壞輔助性T淋巴細胞,使機體的細胞免疫功能受損,最后可并發(fā)嚴(yán)重的機會性感染和腫瘤。該病傳播快、病死率高,且目前無法治愈。在對抗艾滋病的過程中,gp120和gp41是HIV的主要抗原,能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對HIV的中和抗體。HIV侵入人體后雖能刺激機體產(chǎn)生抗體,但中和抗體很少,故難以抑制HIV的繁殖。

HIV中g(shù)p120/gp41蛋白分布在細胞膜表面,gp120介導(dǎo)HIV與CD4+T細胞結(jié)合,被HIV-1感染的細胞能通過其表面的gp120與其它未被感染的CD4+T細胞發(fā)生“細胞融合現(xiàn)象”。因此,以gp120為靶點的抗體可以抑制病毒進入細胞形成合胞體[6]。近年來,以gp120為靶點的單克隆抗體藥物也就成為研究的熱點[7]。Lewis等[8]證明人MAb IgG 1b12能識別gp120與CD4結(jié)合位點重疊的序列,在體外實驗中能中和HIV-1感染。

本實驗通過構(gòu)建重組質(zhì)粒,制備、純化HIV-1 gp120重組蛋白,獲得6株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。結(jié)果表明,6株單抗皆可與HIV-1 gp120抗原特異性結(jié)合,與gp41、gp24、gp36 、gp66、gp51、gp17無交叉反應(yīng)。提示本文制備的抗HIV-1 gp120單抗具有較好的特異性。實驗中表達的融合蛋白Mr為32 000,而目的蛋白gp120的Mr只有6 000。用其免疫小鼠,小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合后鋪10塊96孔ELISA板,獲得4株陽性克隆。這種用融合蛋白免疫小鼠制備單抗,只有盡可能多鋪板,且融合率要很高時,才有可能獲得需要的目的抗體。本實驗使用朱進博士提供的HIV-1 gp120基因片段,該片段是HIV-1 gp120基因的一段恒定區(qū)域,避免了全段基因制備的針對可變異區(qū)域的抗體的產(chǎn)生。

通過對抗HIV-1中和抗體的研究,發(fā)現(xiàn)要想預(yù)防或者控制HIV-1的感染,可能需要多種針對不同表位的中和抗體的協(xié)同作用,而且最理想的是以Env為靶點的多種中和抗體的聯(lián)合應(yīng)用。Frankel等[9]聯(lián)合應(yīng)用單抗 IgG1b12、2F5和2G12,可防止病毒進入人樹突狀細胞,進一步控制HIV-1的感染。本實驗制備的6株抗HIV-1 gp120單克隆抗體,目前正在進行對HIV抑制作用的研究,將為進一步研制抗HIV治療性抗體奠定基礎(chǔ)。

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