水蛭多肽對(duì)局灶大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用

王 希,武建卓,宋淑亮,王允山,梁 浩,吉愛國(guó),

(1.山東大學(xué) 威海國(guó)際生物技術(shù)研發(fā)中心,山東 威海 264209;2.山東大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250012)

水蛭為傳統(tǒng)的破血化瘀藥。新鮮水蛭的唾腺分泌物中含有抗凝血物質(zhì)—水蛭素[1],而經(jīng)干燥后的藥材,水蛭素則被破壞[2],即失去了生物活性。然而,在實(shí)際應(yīng)用中,水蛭是以干燥全體入藥[3],卻仍然具有破血、通經(jīng)的功用。說(shuō)明水蛭中除含有水蛭素外,還有其它的抗凝血成分。另一方面,水蛭因抗凝效果確切,臨床應(yīng)用較多,但其有效成分不明確,尚沒有很好的定量方法。本實(shí)驗(yàn)從中藥干藥材日本醫(yī)蛭(hirudo)中分離純化出相對(duì)分子質(zhì)量(M r)為500～1 000的多肽,并采用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞性腦缺血再灌注損傷模型,觀察水蛭提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦梗死面積、腦組織含水量改變、腦組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)含量等的影響,探討其抗腦缺血損傷的作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

血塞通注射液(批號(hào):20080702),黑龍江省珍寶島制藥有限公司哈爾濱分公司;水蛭多肽(Mr500～1 000),自制;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC),美國(guó)Sigma公司;SOD、MDA測(cè)定試劑盒,均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn),批號(hào):20090504。

健康成年雄性Wistar大鼠(SPF級(jí))180只,體重250～330 g,山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為:SCXK(魯)20030004。

eppendorf centrifuge 5810R低溫離心機(jī);8453E紫外分光光度計(jì),美國(guó)Agilent;T18 basic高速勻漿機(jī),德國(guó)IKA。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組

Wistar大鼠隨機(jī)分成6組:假手術(shù)組、缺血再灌注損傷模型組、血塞通(40mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組、水蛭多肽(80mg/kg)高劑量組,水蛭多肽(40mg/kg)中劑量組和水蛭多肽(20mg/kg)低劑量組[4]。

2.2 給藥方法

模型制備成功即刻腹腔注射給藥,12 h后再次給藥。

2.3 動(dòng)物模型的制備

參照文獻(xiàn)[5],大鼠用10%水合氯醛(350mL/kg,ip)麻醉,仰臥于手術(shù)臺(tái)上,頸正中切開,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA),頸外動(dòng)脈(ECA),頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),用0號(hào)線結(jié)扎并剪斷ECA的分支,分離ICA的顱外分支翼突腭動(dòng)脈。夾閉CCA、ICA,將準(zhǔn)備好的尼龍栓自ECA插入,經(jīng)CCA分叉處通過(guò)ICA入顱至大腦前動(dòng)脈(ACA),尼龍線插入深度約為18 mm。再灌注時(shí)外拉尼龍線使其球端回至ECA內(nèi)即可恢復(fù)大腦中動(dòng)脈的血供。假手術(shù)組除不插尼龍線外其余步驟相同。

2.4 神經(jīng)功能評(píng)分

待大鼠清醒后,按Zea-Longa 5分制法[5]對(duì)各組試驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分(neurological scores)。0分:無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損;1分:不能伸展左側(cè)前肢;2分:行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分:行走時(shí)向左側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。

2.5 腦組織含水量的測(cè)定

缺血再灌注24 h后,每組取10只,斷頭取腦,去除腦干,稱濕重;106℃烘干至恒重,得干重。計(jì)算腦含水量。

2.6 梗死面積的測(cè)定

大鼠缺血再灌注24 h后,每組取10只,斷頭取腦,除去小腦和低位腦干、嗅球。將腦沿冠狀面切成厚度相同的6片,腦片置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TTC溶液10mL中37℃避光染色30 min。正常組織呈紅色,梗死組織呈白色,數(shù)碼相機(jī)正反面拍照,利用Image-pro plus 6.0分析6個(gè)腦片的梗死面積占腦片總面積的百分比。

2.7 腦組織勻漿和生化指標(biāo)的測(cè)定

缺血再灌注24 h后,每組取10只大鼠,10%水合氯醛(350mg/kg,ip)麻醉后斷頭取腦,立即于冰上取出損傷側(cè)大腦,去除嗅球、小腦和低位腦干,稱重,按質(zhì)量體積比1∶9加入4℃生理鹽水,冰浴下15 000 r/min勻漿3 min,制成10%腦組織勻漿液,4℃,3 500 r/min離心10min,取上清液。按試劑盒說(shuō)明,比色法測(cè)定每1 g腦組織中SOD的活性及MDA含量;考馬斯亮蘭法測(cè)定腦組織蛋白含量。

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn),兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)

假手術(shù)組動(dòng)物無(wú)神經(jīng)功能缺損,模型組、血塞通和水蛭多肽給藥組均有不同程度的神經(jīng)功能缺損。其中水蛭多肽高劑量組和中劑量組統(tǒng)計(jì)學(xué)差別明顯(P＜0.01和P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(±s,n=10)Tab.1 Neurological scores(±s,n=10)

表1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(±s,n=10)Tab.1 Neurological scores(±s,n=10)

與缺血再灌注損傷模型組相比較:1P＜0.01,2 P＜0.051P＜0.01,2 P＜0.05 vs focal cerebral ischemic reperfusion injury group

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3.2 水蛭多肽對(duì)腦組織含水量、梗死面積的影響

與模型組相比較,水蛭多肽中劑量組腦含水量顯著降低(P＜0.05);水蛭多肽高劑量組腦含水量明顯降低(P＜0.01)。結(jié)果表明水蛭多肽降低腦含水量,緩解中風(fēng)過(guò)程的腦水腫,且存在一定的量效關(guān)系。假手術(shù)組腦組織TTC染色呈均勻的玫瑰紅色,模型組大鼠可見白色的梗死區(qū),與假手術(shù)相比較明顯增高(P＜0.01)。陽(yáng)性藥可降低缺血梗死面積(P＜0.01),與模型組相比較,水蛭多肽高劑量組梗死面積差異性顯著(P＜0.05)。見表2。

3.3 水蛭多肽對(duì)腦組織SOD活性和MDA含量的影響

缺血再灌注后模型組的SOD活性顯著下降,與假手術(shù)組有顯著差異(P＜0.01),表明缺血再灌注后腦組織SOD活性受到很大影響,水蛭多肽高劑量組能明顯升高腦組織中活性,與模型組相比差異有顯著性(P＜0.05);缺血再灌注后模型組MDA含量顯著高于模型組(P＜0.01),表明缺血再灌注后腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)強(qiáng)烈,伴有腦組織自由基聚集以及抗氧化酶活性的降低,水蛭多肽中、高劑量組能明顯降低MDA含量,與模型組相比差異有顯著性(P＜0.05)。見表2。

表2 水蛭多肽對(duì)大鼠缺血性中風(fēng)腦組織含水量、梗死體積、SOD活性和MDA含量的影響(±s,n=10)Tab.2 Effects of low molecular weight Hirudo peptideson infarction area,water content of brains,superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)level in rats focal cerebral ischemic reperfusion injury(±s,n=10)

表2 水蛭多肽對(duì)大鼠缺血性中風(fēng)腦組織含水量、梗死體積、SOD活性和MDA含量的影響(±s,n=10)Tab.2 Effects of low molecular weight Hirudo peptideson infarction area,water content of brains,superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)level in rats focal cerebral ischemic reperfusion injury(±s,n=10)

與缺血再灌注損傷模型組相比較:1P＜0.01,2P＜0.051P＜0.01,2 P＜0.05 vsfocal cerebral ischemic reperfusion injury group

4 討 論

在急性腦血管病中,缺血性腦血管疾病占50%～70%[6],近年來(lái)發(fā)現(xiàn)發(fā)病后48 h內(nèi),絕大多數(shù)病人的缺血皮質(zhì)已發(fā)生了再灌注。眾所周知,腦缺血后的再灌注是神經(jīng)功能恢復(fù)的基本條件,也是腦組織損傷加重的重要因素。本研究應(yīng)用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型來(lái)觀察水蛭多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,結(jié)果證明,水蛭多肽能明顯減輕腦水腫、縮小梗死面積和改善運(yùn)動(dòng)功能,顯示出良好的腦缺血保護(hù)作用。但其機(jī)制可能與丹皮酚的腦保護(hù)作用機(jī)制不同,丹皮酚是通過(guò)降低腦缺血區(qū)組織黏附分子表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[7]。而水蛭多肽是通過(guò)降低MDA含量、提高SOD活力,減輕自由基反應(yīng)對(duì)腦組織的損害,對(duì)缺血腦組織發(fā)揮保護(hù)作用。水蛭多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制尚待后續(xù)研究探索。

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